18-第18章软骨基质的生物学与成分诱发的关节炎动物模型

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软骨是高度专业化的骨组织，它微妙的半固体结构对维持关节形状及活动至关重要，并赋予关节弹性、耐久性及可变形性。软骨组织由软骨细胞及其合成的胞外基质组成。它的结构与组成反映出特殊的力学特征，包括伸展性(胶原蛋白)、抗压强度(蛋白多糖)及细胞与基质的相互作用(非胶原蛋白)。

      本章在组织与分子水平讨论透明软骨的结构、成分和组成，并涉及软骨抗原免疫应答，及其与类风湿关节炎和脊柱关节病的关系。
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5 K+ Y6 k* o. o1 o9 I第一节 关节软骨的组成

第二节 对软骨的免疫应答及小鼠的关节炎实验模型
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3 q6 x2 Y( N" I5 `第三节 小 结

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软骨的功能是提供几乎没有摩擦力的关节界面并承受外界压力。它由分化中的软骨细胞和包绕这些细胞的胞外基质组成。软骨细胞对软骨的形成至关重要，并在特异性细胞周期基因调控下持续分裂。它合成并分泌胶原蛋白(如II型胶原)与蛋白多糖(如聚合素)，及营造与人体终身共存的胞外基质。软骨细胞还合成及分泌使基质保持丰富弹性的弹性蛋白。所有的软骨细胞都包绕着薄薄的一层细胞周基质，其厚度随部位不同而变化，最厚达2微米。软骨细胞及其细胞周基质一起被称为软骨子(chondron)。软骨细胞密度在胎儿和新生儿的软骨中最高，它随年龄增长而下降。   

      关节软骨的组成形式是为了适应作用于它的拉力、压力及剪切力。软骨分为四个部分:浅表层、中央层、深层及钙化层(图18一1)。浅表层(the superficial zone)也称为切线层，这部分在关节中承受的剪切力、压力和伸拉力最大。在浅表层软骨细胞是扁平的，整个胞外基质的胶原纤维十分薄，而且相互间平行并与关节面平行。在这一区域，小蛋白多糖的核心蛋白聚糖(decorin)高度浓聚，而大蛋白多糖聚合素(aggrecan)的浓度最低。中央层也称为移行层，它是由圆形的软骨细胞及其周围丰富的胞外基质组成，其中胶原纤维的排列没有特别的方向。深层(the deep zone)也称辐射层，其中的软骨细胞常常聚集成团。与深层相邻的是钙化层(the calcified zone)。这两层的交界处有一条边界线，被称为“潮线”(tidemark)，它在苏木素和伊红染色的切片中可以清楚地观察到。软骨细胞的密度在关节表面最高，到中层和深层逐渐减少到表层的三分之一至一半。
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      软骨胞外基质的分子组成
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/ M& J  {; ]0 V. a      胞外基质包括水(65%～80%)、胶原蛋白(15%～25%)及蛋白多糖(10%～15%)。II型胶原蛋白及1X型和XI型胶原蛋白组成原纤维，它们使软骨具有可伸展的特征;蛋白多糖则使软骨具有抗压强度(图18一2A、一2B)


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- I& y5 N% S1 t2 ], _     (一)胶原蛋白   

      1.II型胶原蛋白(Type II collagen)

      II型胶原蛋白主要存在于透明软骨中，占总软骨胶原蛋白的90%。它构成的约300纳米长的胶原纤维是一条由三条相同α链组成的三螺旋结构(triple helix)。在成人的软骨中，II型胶原蛋白的代谢转换率十分有限。
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      2.IX型胶原蛋白(Type IX collagen)

      Ⅸ型胶原蛋白由三种不同的基因产物组成：α1链、α2链和α3链。它在原纤维的表面以反 向平行的方式与Ⅱ型胶原蛋白共价连接。在α1链的N端有球形NC4区，延伸至原纤维外。缺乏Ⅸ型胶原蛋白的小鼠会出现退行性关节炎，因此，Ⅸ型胶原蛋白被认为是组成原纤维基质的重要成分。另外，Ⅸ型胶原基因缺陷还造成软骨发育异常。?

      3.Ⅺ型胶原蛋白(Type Ⅺ collagen)

" v% [5 \1 C7 U+ e" z& o1 \      Ⅺ型胶原蛋白在胶原纤维的内部和表面均有表达。这种胶原蛋白的功能尚不明确，但该分子基因突变的患者可以出现骨骼发育异常和家族性骨关节炎，这提示它在软骨发育和完整性方 面有着重要作用。?

      4.Ⅵ型胶原蛋白(Type Ⅵ collagen)
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* R+ L9 A1 T0 q5 R) n5 e      Ⅵ型胶原蛋白是由α链组成，在它的四聚体结构基础上能够形成具有众多分支的纤维状网络，并与透明质酸（hyaluronan）相关。这种胶原蛋白主要存在于细胞周基质中。?
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9 T& v6 `3 c1 W* r1 v. w$ h      与Ⅵ型、Ⅸ型和Ⅺ型胶原蛋白相似，Ⅹ型胶原蛋白是比Ⅱ型胶原蛋白短的另一种胶原蛋白， 健康的关节软骨中没有Ⅹ型胶原。Ⅻ型和XⅣ型胶原蛋白均与Ⅸ型胶原蛋白有相似的结构和序列，并在软骨中表达。其中Ⅻ型胶原蛋白与软骨细胞的早期成熟相关。
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      （二）大蛋白多糖分子?
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      大蛋白多糖分子（the large proteoglycans），尤其是聚合素和泛能素，使软骨组织具有 抗压强度。这些蛋白多糖的共同特征是具有3个结构区：一个带有糖胺聚糖侧链中心结构区 ；一个G1球形结构区，在氨基端与透明质酸（HA）高亲和力特异结合，造成分子聚合；一个主要与凝集素(lectin)结合的羧基端结构区。正是因为具有这种结构，大蛋白多糖分子也被称为透明凝集多糖（hyalectan），其中G1结构区含有一个凝集素样透明质酸结合位点。?
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2 [  A: n" m) z) |) w% A      1.聚合素（aggrecan）
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5 P8 b$ b: c0 N8 R* x) E# J       聚合素实际上是一种软骨特异性蛋白多糖，由软骨细胞合成并不断分泌。它包含一个约220kD的核心蛋白，并具有第二个球形结构区（G2），而蛋白多糖的其他成员则没有。有一个重要的球间结构区（IGD）将N端的G1和G2结构区分开，IGD由一个外显子编码包含一个天然的聚合素酶切位点。在紧邻G2结构区竣基端的区域包含有大约30条高密度的硫酸角质素(keratan sulfate)链。富含硫酸角质素的区域可以与II型胶原结合，这可以解释以前观察到的聚合素与胶原纤维的直接结合。与这一区域相邻的是两个大的连接有硫酸软骨素(chondritin sulfate, CS)的结构区，称为CS1和CS2。CSI和C52结构区含有超过 100条的CS链。
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. [; _8 M5 c( u      2.泛能素(versican )

0 G" ?) ~% R7 o/ O  G2 z0 |# H, a      泛能素位于多种器官的结缔组织中，通常与弹性纤维网络有关，比如纤维和弹性软骨。它也在关节软骨中表达，在椎间盘中含量非常丰富。泛能素的核心蛋白含有表皮生长因子样、EGF-like)序列，这些序列被释放出来则可能影响成骨细胞的代谢。G3结构区可以抑制间充质中的软骨生成，这是否意味着泛能素与软骨的修复有关，目前尚不清楚。   

      3.透明质酸(HA)和连接蛋白（LP）   
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      这两种分子与聚合素和泛能素密切相关。透明质酸(hyaluronan, HA)是无分支的长多糖链，平均分子量的上限可达数百万，每一条链可以结合大量的聚合素，形成分子量达数亿的聚合体。连接蛋白与聚合素的G1结构区以及HA直接结合，起到稳定聚合体的作用(图18一2C)。

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7 i" U6 z& F2 O% ^      (三)富含亮氨酸的小蛋白多糖

      核心蛋白聚糖(decorin )和双链蛋白聚糖(biglycan)有着相似的分子大小和结构，是由一系列富含亮氨酸的共有序列串联重复组成。通常它们共同分布在成人的软骨中，主要集中在关节面下和细胞周围，在软骨深层含量很少。核心蛋白聚糖与I型和II型胶原结合，在骨与软骨基质中形成原纤维。在核心蛋白聚糖基因敲除小鼠中，II型胶原纤维的聚合受到破坏，软骨的伸展性明显下降，而在双链蛋白聚糖基因敲除小鼠中，则没有上述改变。   

      还有许多其他种类的蛋白多糖和其他类型的分子在软骨基质中表达，有着已知或未知的功能，这些分子见表18一1。


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与角膜相似，软骨也是一种无血管的组织，免疫系统通常不能进人关节软骨的胞外基质。因此，软骨被认为是免疫豁免器官。但是，随着疾病过程中蛋白多糖的丢失，软骨对T细胞和抗体的通透性增加。类风湿关节炎患者的血循环中出现抗软骨抗原的抗体十分常见;而且这些患者的T细胞对软骨蛋白多糖免疫应答的频率也明显增加。尽管RA及其相关疾病造成持续慢性进行性的关节破坏，但是在关节成形术中切除关节软骨(保留有炎性反应的滑膜)或在疾病晚期最终失去关节软骨，均使关节炎性反应消失。因此，关节软骨与关节炎症密切相关。   
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      关节炎存在时，II型胶原、聚合素和连接蛋白均被金属蛋白酶降解，聚合素主要在球间结构区(IGD)被裂解。连接蛋白主要在氨基端被酶切，裂解部位在第一个球形结构区(G1)弯曲部分。在体内和体外的软骨裂解过程中，聚合素和连接蛋白的G1结构区均被释放出来，出现在滑液中，并可在滑液诱发免疫反应。启动抗原特异性细胞免疫应答需要在抗原递呈细胞(APC)表面表达抗原多肽(抗原表位),APC将这些抗原表位递呈给活化的T细胞和B细胞。传统的抗原递呈细胞是树突状细胞、B细胞和巨噬细胞，这些细胞的表面表达 MHC II类分子，如HLA-DR, DP和DQ。正常人的软骨中不存在传统的APC，软骨细胞也不表达MHCII类分子。然而，关节炎患者软骨浅表层的软骨细胞表达MHC II类分子，这可能是在炎症刺激下由于 IFN-γ的局部作用造成的。考虑到软骨细胞含有不同的软骨特异性抗原和其他组织特异性分子，因此在理论上说，软骨细胞是一理想的非传统APC，可以递呈局部抗原并启动免疫应答。在易感动物种系的实验中，可以诱发出类似RA和脊柱关节病(SpA)的急性和慢性关节炎。不过，这里只讨论软骨抗原诱发的动物模型及其临床意义。
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# \  }( U7 a3 ]1 j9 w3 S& D   一、II型胶原诱导的关节炎  

      II型胶原是第一个被确定可以在实验中诱发多关节病变的胶原纤维，在DBA/1小鼠和灵长类动物中可造成侵蚀性关节炎。这种多关节病变被称为II型胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)。II型胶原的体液免疫和细胞免疫均参与了CIA的发病。除了II型胶原，IX型和XI型胶原也可以在易感小鼠中诱发多关节炎，因为它们与II型胶原具有相同的关节抗原决定簇(arthritogenic determinants) oMHC基因对CIA有很强的控制作用，其中H-2q和H-2r单体型是最易感的基因型，但H-2r小鼠仅对某些动物(如猪、牛和鹿)的II型胶原易感。对 CIA有抵抗作用的基因型是 H-2s,d,b,j,v,k,u和p。近来有关CIA的一项重要进展是对HLA-DR4, HIA-DR1和HLA-DQ8转基因小鼠CIA易感性的研究。这些基因位点的出现提示患RA的危险性增加。HLA-DQ8转基因小鼠对牛和鸡的II型胶原诱发的CIA易感，但对人的II型胶原不易感。HLA-DR1(DRB1 * 0101)和HLA-DR4 (DRBI*0401)转基因小鼠均可出现自身免疫性关节炎，其组织学改变及严重程度与以前描述的胶原诱导的关节炎模型相似。在这些动物中，T细胞和B细胞对免疫原和小鼠II型胶原的自身抗原都可产生免疫应答，因此证明了RA相关的HLA-DR分子直接参与对II型胶原的自身免疫反应和疾病发生的调节。另外，DR4限制性T细胞对人II型胶原产生免疫应答的免疫原性决定簇主要集中在II型胶原263～270氨基酸，次要决定簇在286～300氨基酸。这些位点与最近确定的另一个RA易感基因HLA-DR1(DRB1*0101)的决定簇相同。以上资料证明，HLA-DR转基因动物提供了与人体相似的环境，有利于确定RA关节抗原的T细胞表位。  

      在小鼠中诱发CIA依赖于产生与小鼠软骨胶原有交叉反应的抗体。目前已经确定了具有构象依赖性和线性隐蔽的B细胞表位。后者只有在三螺旋结构变性时才能与抗体结合，例如，变性可发生在生理温度下被胶原酶裂解后。一般而言，仅仅是抗II型胶原抗体本身还不足以造成关节炎的所有表现。人体 B细胞的免疫应答一般针对变性的II型和IX型胶原。因为降解的胶原片段可以从软骨中释放出来并被免疫系统识别，故这一现象并不出人意料。这种识别在不同患者中有所不同。在银屑病和强直性脊柱炎患者的血清中存在抗II型胶原抗体，这与出现的多关节炎相关。但是在CIA动物中，从组织学上并没有发现骶髂关节炎和脊柱炎。II型胶原特异性抗体补体复合物在RA患者的关节软骨浅表层中十分常见，而在骨关节炎患者中不常见。除了产生抗体的B细胞，疾病的发生还需要有携带α/β型T细胞受体的CD4+T细胞。在RA患者中T细胞对变性或天然的II型胶原产生免疫应答并不少见。在RA病变部位浸润的T细胞有高度的异质性，虽然T细胞的寡克隆扩增已有报道，但尚未发现占优势的T细胞克隆。
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" h, e- w9 V! o/ r   二、聚合素诱导的关节炎  
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      当用从人胎儿软骨中提取的聚合素与完全或不完全弗氏佐剂对 BALB/c小鼠进行免疫后，小鼠会出现侵蚀性多关节炎和强直性脊柱炎。脊柱炎出现于腰椎和尾部，表现为椎骨周围炎及血管翳对椎间盘的侵蚀，随后发生明显的软骨生长板退化，终板吸收及椎间盘破坏。推测聚合素的关节抗原和脊柱抗原位于牛聚多糖分子与透明质酸结合的Gl结构区，这个结论被重组的人聚合素G1结构区所证实。这类关节炎的炎性病变特点是在肌腱端插人椎体的纤维环外层有单核细胞浸润，这与强直性脊柱炎病变中所见到的相同。炎性反应与血管生成有关，并发展成对终板的破坏性病变及椎间盘炎症。对Gl表位特异性T细胞的研究表明，病变局部免疫原或其片段的产生和释放会造成T细胞归巢(homing)，而由此造成的炎性破坏会使更多的表位被释放出来，从而吸引更多的致病性T细胞。用蛋白多糖进行免疫也可以在其他小鼠种系(C3H/HeJCr)中诱发严重的关节炎。
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     聚合素是一种有效的免疫原。有报道kA患者出现抗聚合素抗体。有趣的是，有证据表明强直性脊柱炎患者可以出现蛋白多糖特异性T细胞。RA患者对聚合素Gl结构区的免疫应答增强，并且聚合素特异性T细胞不但出现于RA患者，健康献血者也有。它在滑液中出现的频率最高，其次是RA患者的外周血，最低的是健康献血者的外周血，依次要低一个数量级。这些 T细胞大多数属于产生Thl促炎细胞因子的CD3+CD4+CD8- 类型。严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的转移实验显示，这些聚合素特异性T细胞直接参与了关节炎的发病，这个实验模拟了这些T细胞在具有关节归巢机制的同品系BALB/c小鼠中的致病作用。有趣的是，在复发性多软骨炎患者中也发现了聚合素反应性T细胞。
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# x1 u# T0 f" p  W   三、泛能素诱发的骶髂关节炎和脊柱炎

      泛能素是聚合硫酸软骨素蛋白多糖家族的成员。人类泛能素有三种异构体(V0, V 1和V2)，是mRNA变位剪接所致。所有异构体均有相同的Gl结构区，它与透明质酸和连接蛋白结合。泛能素在人类椎间盘髓核和纤维环中的含量远远超过在关节软骨内的含量。另外，在韧带和肌腱中也发现存在泛能素。泛能素Gl结构区(VG1)氨基端的前350个氨基酸的序列和结构与聚合素G1结构区(AGl)和连接蛋白有高度的同源性。用重组的人VGl免疫BALB/c小鼠可以选择性地诱导产生具有肌腱端炎特点的骶髂关节炎和脊柱炎，而没有明显的外周关节受累。T细胞识别VGl的主要表位参与了这一免疫反应。对这个表位的免疫应答与对人重组AG1及其多肽或小鼠相应的VGl没有交叉反应。B细胞的识别区域被确定在人VGl最保守的结构区中，它与人聚合素Gl具有相同的序列。这一区域也同样出现在小鼠VGl和AGl中。B细胞对VGl的免疫应答与对AG1的免疫应答间存在交叉反应。针对VGl和AG1共同或单独的免疫应答使人与小鼠间可能出现交叉反应，并导致自身免疫反应。这些观察提示，对泛能素和聚合素发生的免疫应答在强直性脊柱炎患者的脊柱和骶髂关节病变中可能发挥着重要作用。
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% r5 X6 S7 a7 w3 O( j4 _) ]! J9 H   四、连接蛋白及HCgp-39诱导的关节炎
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      软骨连接蛋白和人软骨糖蛋白-39 (HCgp-39)均可在BALB/c小鼠中诱发关节炎而无中轴关节受累。在对连接蛋白的免疫反应中，需要T细胞和 B细胞对表位的识别。人们注意到软骨基质蛋白1(matrilin-1)可以诱发大鼠出现复发性多软骨炎，它累及气管、鼻和外耳，但不累及大鼠的外周关节。Matrilin主要在气管软骨中表达。在幼年类风湿关节炎患者中可观察到对连接蛋白的免疫反应，在 RA患者中也发现了针对软骨HCgp-39的细胞免疫反应。

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许多软骨基质蛋白或结构区，如II型、IX型和XI型胶原、软骨糖蛋白39、聚合素G1结构区、泛能素Gl结构区及连接蛋白等，是诱发易感动物出现多关节炎的潜在抗原(表16一2)。一般情况下，II型、IX型和XI型胶原、软骨糖蛋白39、软骨基质蛋白和软骨连接蛋白诱发的多关节炎并没有脊柱炎。似乎只有蛋白多糖(聚合素和泛能素)才诱发骶髂关节炎和脊柱炎。这两种分子均是椎间盘的结构蛋白，而且已确定这两种分子的关节抗原和/或脊柱抗原的表位均存在同源性的氨基端G1球形结构区。这些区域显示泛能素和聚合素之间有明显的结构同源性(52%)。这种结构同源性只存在于G1球形结构区内，它们集中在聚合素G1结构区第115氨基酸残基至羧基端第332氨基酸残基之间的区域内，位于聚合素天然裂解位点DIPEN附近。  

5 N% a2 P* D: V/ v      风湿性疾病，尤其是强直性脊柱炎的关节外病变很常见。许多关节外组织如眼的角膜和动脉的中层，也含有II型胶原、聚合素和泛能素的GI结构区及连接蛋白。泛能素还存在于中枢和周围神经系统中。因此，在关节外的相关组织有可能对软骨的Gl结构区和连接蛋白发生免疫交叉反应。在肌腱和上斜肌中出现泛能素也许可以对幼年或成年慢性类风湿关节炎患者同时出现一过性获得性 Brown综合征作出解释。因此，这些软骨蛋白在关节外的表达与风湿性疾病的关节外病变是否相关就成为一个令人感兴趣的课题。  

: n  n: [% S' ?( I. M9 z6 \- x      三个不同的人类软骨基质分子的保守结构区有很强的同源性，它们依次是泛能素G1结构区(VG1)，聚合素G1结构区(AGl)和连接蛋白。每种分子均可在BALB/c小鼠中诱发独特的关节炎。VG1仅仅诱发脊柱炎，连接蛋白诱发外周关节炎而没有脊柱炎，AG1能够同时诱发中轴和外周关节炎。 目前还不清楚为什么这些相似的分子能够造成不同组织的不同病变，其中具体的免疫致病机制有待进一步研究。
                                                                                                                                                               （ 张一平 ）
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