17-第17章 清膜与滑膜细胞

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3 z) f6 A5 P5 D4 K! R. x2 m8 q第一节 正常滑膜的结构

, W0 e1 _) e6 K5 U$ p第二节 滑膜细胞的形态分类和功能

第三节 滑膜细胞的分子病理学

* H. {  B/ `  P) m第四节 成纤维样滑膜细胞转化特性在RA发病机制中的重要作用及其临床意义

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滑膜层作为关节囊的内层，由平滑光亮、粉红色、薄而柔润的疏松结缔组织构成，紧贴关节囊纤维层的内面，附着于关节软骨的周缘(彩图17一1)。除了关节软骨、关节盘及纤维软骨性半月板的中央部分以外，滑膜覆盖关节内的所有结构。有时滑膜层从纤维素缺如处突出，形成滑膜囊。关节的血管穿过纤维层，在关节面周围的滑膜内形成丰富的血管网。显微镜下，可以见到滑膜层内表面常有些微小的突起，称为滑膜绒毛。滑膜绒毛可以增加滑膜的面积，有利于滑液的分泌和吸收。随着年龄的增长，绒毛的数量和大小也增加，在某些病理情况下则有明显增加。正常人体中各个关节的滑膜面积总和约为 1000 cm 2，其中膝关节中约占一半。在关节软骨的边缘，滑膜形成皱装，可以使该组织随着关节活动被拉长而不受损伤。滑膜皱装内含有脂肪垫，当关节活动引起关节腔的形状、容积和压力发生改变时，滑膜脂肪垫可以发挥调节作用。
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      滑膜可以分为靠近关节腔的滑膜内层及滑膜下层。
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      滑膜内层又称作滑膜衬里层，由多形性的滑膜细胞和滑膜细胞间颗粒状、无定型的基质组成，不含纤维成分，也无血管和淋巴管。正常人的关节滑膜衬里层有 1-3层的滑膜细胞，厚20--40tAm，呈不连续性，但不同的关节或者同一关节的不同部位的滑膜细胞形态和数目可以有显著差异，这种差异决定于滑膜下层的组织特点。例如，滑膜在其易于受压的部位、韧带与肌腔上方和蜂窝状的滑膜下层组织上方，滑膜衬里层细胞稀疏，而在纤维性滑膜下层结缔组织上方的滑膜细胞常紧密排列，细胞可以呈扁平状，因而形成内皮样结构。  

      滑膜下层，又称滑膜衬里下层，主要由成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、肥大细胞、胶原纤维和蛋白聚糖组成，含有丰富的血管和淋巴管。血管内皮细胞在维持正常滑膜细胞的营养方面起着重要作用。滑膜内还可以见到毛细血管后的高内皮微静脉。高内皮微静脉是由扁平的内皮微静脉在抗原活化 T细胞分泌的细胞因子作用下转化而来的，它是由高立方形内皮细胞表面表达血管定位素作为各种淋巴细胞归巢受体的配体，因而可以促进淋巴细胞从血循环中游出。

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一、滑膜细胞的形态分类   
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      正常的滑膜组织中，滑膜细胞主要指与关节腔毗邻的滑膜衬里层细胞，通常为1-3层，与滑膜下层细胞二者之间没有基底膜相隔。   

      滑膜细胞呈椭圆形，有许多胞浆突起，细胞间的形态可以有明显差异。根据形态学差异，可以将滑膜细胞分为A型,B型及尚有争议的C型三类。滑膜细胞的确切来源目前还有争论。这些细胞类型可能只是滑膜细胞的不同发育阶段，但是也可能具有不同的功能，目前尚不明确。   

      A型滑膜细胞是巨噬细胞样滑膜细胞，可能起源于骨髓，属于单核巨噬细胞系的一个组成部分。电镜下观察(图17一2)，该细胞的表面有许多皱摺或者指状突起深入周围的基质;胞内高尔基体发达，有许多的大泡、小泡、吞饮泡、溶酶体以及各种内含物，但是粗面内质网不发达;核仁中含有大量致密的染色质。免疫组织化学表明，A型滑膜细胞具有巨噬细胞特征样的表面受体。微丝含量丰富，沿细胞的纵轴排列。正常情况下，20%～30%的滑膜细胞为A型细胞。
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      B型滑膜细胞是成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)，为间充质来源。胞浆内含有丰富的粗面内质网，而大泡、小泡罕见，核染色质较为疏松，核仁发育好，胞膜皱褶较少(图17一3)。绝大部分种属的滑膜细胞以B型为主，生理情况下约 70%～80%的滑膜细胞为B型细胞。  

      C型滑膜细胞，形态上界于A和B型滑膜细胞之间，胞浆中同时含有粗面内质网、高尔基复合体及大泡等。现在发现其具有树突状细胞的特点，故称为树突细胞样滑膜细胞。   

7 d2 |( y( _7 F/ [/ [" a      滑膜细胞的形状并非终生不变。当疾病影响滑膜细胞时，它们经常会出现形态改变，或者过度增殖，或者呈现凋亡。

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   二、滑膜细胞的功能

      滑膜细胞的主要功能是构成关节内的滑膜组织，向关节腔内分泌糖胺聚糖等润滑分子，并供给关节软骨及相邻骨的氧与营养性血浆蛋白。尽管组织定位相同，但是滑膜细胞具有不同的生物功能和分子功能。巨噬细胞样滑膜细胞主要表达CD11b, CD14, CD33和CD68等表面标志;但是在不同分化阶段 CD分子的表达不同。A型巨噬细胞样滑膜细胞具有吞噬关节腔内碎屑的功能，还具有细胞递呈作用。它们主要表达Fc受体、雌雄激素受体和MHC II类分子(HLA-DR和DQ)。B型成纤维样滑膜细胞的主要特征是产生透明质酸，润滑关节，并且还合成许多细胞基质成分包括胶原、分泌酶类参与软骨和骨的降解。B型滑膜细胞缺乏特异的HLA-DR分子标记，不能用特异的抗体进行识别。滑膜细胞之间以及与其他细胞之间通过受体、细胞因子、生长因子和化学因子相互作用。为了进一步明确滑膜细胞生物学行为和功能的不同，避免与B型淋巴细胞在名称上混淆(浆细胞)，因此，A型滑膜细胞被称为巨噬细胞样滑膜细胞，而B型滑膜细胞被称为成纤维样滑膜细胞。  
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      另外一组不同的细胞群体为CD14 /33阳性细胞，有时命名为树突状滑膜细胞。此类细胞在类风湿关节炎中参与递呈抗原给T细胞，与影像学上关节破坏密切相关。树突状滑膜细胞通过在溶酶体中产生并释放前列腺素参与滑膜炎性病变。

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总的来讲，炎性滑膜中各种细胞类型均有所增加。任何一种关节炎性疾病，滑膜内都会有血液源性或者骨髓源性的细胞，如T细胞、B细胞和单核细胞浸润。尽管类风湿关节炎的始发环节尚不明确，但是在炎症反应之前，淋巴细胞已经开始在滑膜下层终末血管周围聚集。类风湿关节炎的另一主要特点是衬里层的滑膜细胞异常增生，并且具有转化细胞表现，侵蚀周围的骨与软骨。具有转化特性的成纤维样滑膜细胞含有大而苍白的细胞核，核仁突出，胞浆丰富。这些细胞异常增殖，并且在功能上处于异常活化状态，分泌大量蛋白酶类和信号分子。巨噬细胞样滑膜细胞，形态上改变不大，但是通过增加细胞因子和蛋白酶类的分泌促进关节的炎性破坏进程。  
      随着分子生物学研究的深入，对于类风湿关节炎滑膜细胞的作用和功能已经有了新的认识。最新研究资料表明，类风湿关节炎的关节破坏进程中，除了通常的 T细胞依赖途径以外，还存在非T细胞依赖途径。以前一直认为成纤维样滑膜细胞仅仅是产生透明质酸，起润滑关节作用。后来Fassbender发现FLS具有转化特性，现在已经确定这类细胞为介导RA关节破坏病理过程的主要细胞。RA FLS中存在原癌基因过度表达，使滑膜细胞附着于软骨表面并表现异常增殖，基质金属蛋白酶和组织蛋白酶产生增高，介导这些细胞侵蚀和破坏软骨。RA滑膜细胞功能的改变还包括增生与凋亡的失调。将RA患者的滑膜与软骨共同植入严重联合免疫缺陷(severe combined immunode-ficiency, SCID)小鼠体内200天，在没有T细胞存在的情况下，滑膜细胞仍然表现侵蚀软骨的特性。另外，还有许多研究揭示了RA滑膜组织中细胞间和细胞一基质间的相互作用调节滑膜细胞的功能。受体-配体间的相互作用，包括细胞间粘附分子如 ICAM-1(细胞间细胞粘附因子一1 ), ICAM-2和 ICAM-3的表达，VCAM-1(血管细胞粘附因子-1)的表达和E-LAM-1(内皮白细胞粘附分子-1)或者E-选择素，以及其他一些纤维连接素的剪切形式，通过信号机制参与血液中单核细胞向滑膜组织中的迁移过程。  
一、滑膜细胞粘附分子的表达及与其他细胞和基质间的作用  
      滑膜细胞与其他细胞和基质的相互作用主要通过粘附分子介导。大部分的粘附分子可以归类为选择素、整合素和免疫球蛋白超基因家族。对RA滑膜中粘附分子功能的认识大多局限在T细胞之间和血管内皮细胞之间，而对于滑膜细胞表面粘附分子的表达情况还知之甚少。  
' M$ ^* `3 y/ R! X; k      近来研究表明，滑膜细胞表面主要表达免疫球蛋白超基因家族的成员。与巨噬细胞特异性抗原CD68的抗体联合应用进行双标记发现，参与关节软骨破坏进程的RA成纤维样滑膜细胞主要表达VCAM-1，而在OA中表达较少。因此，VCAM-1在RA的滑膜细胞中发挥多种重要的功能。在滑膜微血管中，VCAM-1主要与淋巴细胞膜VLA-4(极后期激活作用抗原-4)结合，VLA-4同时可作为纤维连接素另一种剪接形式CS-1的配体。VCAM-1可能使滑膜细胞易于与软骨和骨粘附。其他粘附分子如ELAM-1主要表达在血管内皮细胞表面，而不是在滑膜衬里层细胞表面。   
      巨噬细胞样滑膜细胞表达较多的细胞间粘附分子ICAM-1。ICAM-1主要与不同类型淋巴细胞表面的LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)相结合，后者属于整合素受体家族。ICAM-1在正常和RA的滑膜细胞表面都有表达，并可以在细胞因子的诱导下表达增加。在体外培养的成纤维样滑膜细胞中，ICAM-1表达水平较低。但是，当用不同的细胞因子，如IFN-γ,IL-
1和TNF-α作用时，ICAM-1的表达明显增加。ICAM-1在RA病程进展中的作用得到临床实验的证实。短期应用ICAM-1的单克隆抗体进行治疗，一半以上的RA患者出现临床症状的改善，而无明显副作用。近来在巨噬细胞型滑膜细胞表面发现一种新的白细胞受体(LFA-1)的配体，但是其功能尚不清楚。   
      免疫球蛋白超基因家族中的另外一种粘附分子CD31，在巨噬细胞样滑膜细胞和成纤维样滑膜细胞的分子表面都有表达，并在滑膜组织中发挥粘附作用。其他的粘附分子，如E-选择素,L-选择素和P-选择素也在RA的滑膜组织中有表达，粘附分子在滑膜细胞表面的表达促进与其他炎性细胞如淋巴细胞，单核-巨噬细胞的结合。既然它们的主要作用是参与滑膜组织中单核细胞与内皮细胞间的相互作用，它们很可能成为类风湿关节炎治疗的新的靶向分子。
   二、滑膜细胞周期失调:增生与凋亡  
      近来的研究表明，成纤维样滑膜细胞的异常增殖和侵蚀特性主要由于细胞周期(增殖/凋亡)的失调所导致。一般情况下，凋亡主要由细胞表面表达的fas受体、TNF-α受体和激素受体等激发，导致DNA的降解和死亡细胞的吞噬。原癌基因 bcl-2有抗凋亡的作用，主要位于线粒体内膜、内质网和核膜上。bcl-2主要抑制凋亡的终末环节。在 RA滑膜组织中，仅有3%的具有转化特性的滑膜细胞容易发生凋亡。凋亡基因fas的mRNA主要在终末血管周围的细胞中检测到。而一些易于粘附并侵蚀软骨与骨的滑膜衬里层细胞主要表达凋亡抑制基因bcl-2。这些研究表明，滑膜衬里层凋亡细胞的减少，可能是因为 bcl-2的表达导致在滑膜侵袭破坏骨和软骨的部位，分泌基质金属蛋白酶的细胞周期延长。   
      Carson与Ribero建立了一个模型用来阐明滑膜细胞增殖与凋亡失调的分子事件。原发刺激因素是原癌基因c-myc的过度表达，其他刺激因素决定细胞是增殖还是凋亡，bcl-2上调而fas下调细胞增殖，反之则细胞凋亡。近来的研究还发现，除了fas以外，穿孔素(Perforin)也介导细胞毒性，穿孔素与颗粒酶A的mRNA在RA滑膜组织的细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞的颗粒中都有表达。据推测，滑膜组织中这些凋亡诱导分子直接针对的是具有转化活性的成纤维样滑膜细胞。
- S* w2 f' [# T. N5 d- g6 L   三、滑膜细胞与细胞因子和生长因子
! C+ B! q' n/ b$ I% V" M      细胞之间主要通过“细胞因子网络”来发挥相互作用。近来，发现了许多新的细胞因子。不仅淋巴细胞等血源性细胞可以分泌细胞因子，成纤维样滑膜细胞和巨噬细胞样滑膜细胞也可以自发或者在诱导下产生细胞因子:包括IL-la, IL-1(3, IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IFN-γ,TNF-α,TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF )、表皮生长因子(EGF )、血小板生长因子(PDGF),GM-CSF和M-CSF等。   
: G5 N2 n2 z# P3 i7 ^, \/ y7 J      尽管关于类风湿关节炎疾病发生的始发环节的决定因素研究尚无定论，但是就目前的认知程度而言，RA是一种主要由细胞因子参与介导的慢性炎性疾病，以滑膜细胞的异常增殖、大量炎性细胞浸润、关节的进行性破坏为特征。鉴于治疗RA传统药物(包括一线非类固醇抗炎药NSAIDs，二线病情控制类药物DMARDs)的较重副作用和有效性差，以细胞因子为靶向的抗细胞因子作用的治疗手段已经广泛投入到实验研究中，开始了RA生物治疗的时代。以Pittsburg大学Christopher Evans教授为首的研究组进行的IL-1 Ra基因治疗方案已经获得美国FDA批准进人临床II期实验阶段;以TNF-α为靶向的抗细胞因子的生物治疗方法，如抗hTNF-αmAb及其可溶性TNFR融合蛋白已在临床使用，对RA的治疗效果显著。   
      一些细胞因子可以诱导滑膜细胞产生其他细胞因子和基质降解酶。除了检测各种细胞因子在衬里层滑膜细胞的表达和表达量的多少以外，最有趣的问题是这些分子在细胞因子-滑膜细胞-细胞因子网络中发挥的作用以及各种细胞因子在滑膜细胞中的信号转导机制。   
      TGF-β, FGF和PDGF是生长因子家族成员，主要诱导细胞增殖。TGF-β主要由巨噬细胞产生，在滑膜和滑液中都有大量表达。它的作用发挥取决于所在部位和浓度。在动物实验中，将TGF-β注人关节腔以后，可以刺激衬里层滑膜细胞增殖和胶原的产生。它也可以干扰IL-1受体，抑制T淋巴细胞。FGF是滑膜衬里层细胞和血管内皮细胞自分泌产生的细胞因子，促进局部成纤维细胞的增殖。PDGF含有两个多肽链，B链主要由巨噬细胞样滑膜细胞产生。PDGF出现在滑膜衬里层，是滑膜细胞生长的强刺激因素。PDGF是少有的导致成纤维样滑膜细胞呈现转化特性的细胞因子之一。   
      IL-1β,TNF-α等炎性因子形成的细胞因子网络在促进成纤维样滑膜细胞功能活化，并进一步导致其对关节软骨和骨侵蚀的病理过程中发挥重要作用。IL-1β的分子量为17kD，主要由单核-巨噬细胞合成并分泌，在不同的靶细胞中引起多重生物学效应。例如，它可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，刺激破骨细胞骨吸收，参与发热，增强肝急性期反应和血管形成，促进抗体和细胞因子的产生，促进软骨降解，刺激成纤维细胞、平滑肌细胞和间质细胞增殖，增强HIV-1基因表达等。TNF-α是主要由单核-巨噬细胞产生的17kD多肽分子，作为一种重要的炎性细胞因子及免疫反应介质，在不同类型细胞中引发多种生物学效应。如TNF-α可以刺激肝脏产生急性期蛋白介导内毒素性休克，促进成纤维细胞、造血细胞有丝分裂，抑制肿瘤细胞的生长。   
      在RA的病情进展中，滑膜组织和滑液中IL-lβ,TNF-α在促进成纤维样滑膜细胞功能活化并导致关节炎性破坏的过程中发挥类似的重要作用。可以诱导 IL-8, IL-6等炎性因子产生，促进MMPs, PGE2的合成，增强粘附分子ICAM-1, VCAM-1的表达，从而使滑膜成纤维细胞作为辅助细胞通过上述共刺激信号与T细胞发生作用。另外，TNF-α的转基因小鼠出现多关节炎性改变。
# K  o6 N' n( d8 a1 n      然而，对于IL-1β和TNF-Α在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的信号传导机制至今尚不明了。IL-1β和TNF-α的信号传导具有以下几个共同的特点:   
. o% a1 K0 t& c6 T      (1)IL-1R和TNFR的胞内区与其他细胞因子或生长因子不同，不具备任何激酶活性，但是却可以诱导许多蛋白分子发生磷酸化。
      (2) IL-1β和TNF-α的信号传导具有细胞特异性，对于不同来源的细胞，IL-1β或TNF-α可以激活不同的信号分子，从而引发不同的生物学效应。  
      (3)IL-1R和TNFR的信号传导具有惊人的高效性。
9 n! \! {" |# i) ^      (4)到目前为止，尚未发现一种特异的信号传导通路介导IL-1β和TNF-α与相应受体结合后的最早期效应。   
      (5) IL-1β和TNF-α可能共享相同或者相似的信号传导通路。   
      由此可见，IL-1β和TNF-α极可能平行活化多条信号通路，它们之间相互协同，共同引起放大的生物效应。孙铁铮、吕厚山等研究证实，IL-1β和TNF-α可以瞬时引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加，并同时激活MAPKs(有丝分裂原活化的蛋白激酶)三条信号通路(ERK2,JNK2 , P38 )，两种因子诱导MAPKs活化过程中既有酪氨酸激酶(PTK)依赖途径，又有非PTK依赖途径存在。   
4 `+ h0 V% g/ Q* s" k" `      不仅RA的滑膜细胞产生细胞因子，而且骨关节炎患者也可以产生类似的细胞因子。只不过 RA中 IL-1、IL-6、GM-CSF和TNF-α和EGF含量明显高于OA，这可能也反应了RA滑膜细胞的过度活化状态。抑制性细胞因子IL-10既可以在RA，又可以在OA中产生。重组的IL-10可以抑制体外培养的滑膜组织炎性细胞因子的产生，因此具有潜在的治疗价值。
   四、滑膜细胞增殖、原癌基因的表达和基质降解酶类   
      RA中具有转化特性的成纤维样滑膜细胞主要存在于与软骨和骨的交界处。有很多证据表明，调节细胞周期的特异性原癌基因的过度活化，导致基质降解酶类的产生增多。
7 h  j2 A# E7 t" |( u1 T% g      RA成纤维样滑膜细胞的异常活化与多种参与细胞周期调控的原癌基因的过度表达有关。早期生长反应基因和增殖相关基因都参与RA的疾病进程。   
: p1 z. ~+ n3 C: [1 z! F      在RA中，c-sis /PDGF系统是研究较为透彻的促进滑膜细胞增生的主要分子。PDGF,主要由血小板、内皮细胞和巨噬细胞样及成纤维样滑膜细胞产生，与IL-1作用相对抗。PDGF在RA FLS中主要促进增殖。RA FLS编码PDGF的mRNA表达升高，而且与肝素结合酸性成纤维细胞生长因子(α-FGF)的表达有关。
      早期反应基因也参与滑膜细胞活化的早期环节，如EGR-1，由锌指基因Z-225编码，在RAFLS中表达增高，并且这种异常增高持续几代以上。RA滑膜组织中许多不同种类的细胞中都有EGR-1的过度表达。因为EGR-1参与调节其他原癌基因的表达，如sis和ras，后二者在RA滑膜组织中也呈过度表达状态，因此，EGR-1可能是导致 RA滑膜细胞增生的早期事件。  
4 C+ s; a$ b2 t) _       RA FLS中还表现c-fos的过度表达，c-fos蛋白主要参与组织降解酶类如胶原酶、基质蛋白酶的活化。fos蛋白与jun形成AP-1复合物，后者作为一种转录活化因子，参与胞核内的磷酸化过程，许多细胞因子和生长因子如EGF, FGF, PDGF, TNF和IL-1参与c-fos和c-jun的产生和活化，进一步促进AP-1复合体形成，这些早期反应基因促进了胶原酶和基质金属蛋白酶类的表达。另外，胞浆中的糖皮质激素受体可以与c-fos和c-jun形成类似于AP-1的复合物，这可能揭示了激素抑制RA胶原酶的产生机制。   
- `, b. N4 x3 G4 t; B      此外，RA FLS中 ras、c-myc也表现出过度表达。体外实验研究也发现，转染 ras基因后，成纤维样细胞具有转化特性，而且诱导组织蛋白酶 L的产生。组织蛋白酶 L不但与 ras表达的程度有关，而且和细胞的迁移特性密切相关。组织蛋白酶L可以降解I、II、IX和XI型胶原和蛋白多糖，增殖的滑膜细胞产生这种蛋白酶，在RA的软骨破坏过程中发挥重要作用。   
      RA滑膜细胞产生的基质降解酶类多于骨关节炎(osteoarthritis, OA)，这在很大程度上反应了细胞的过度活化状态。但是，这两种疾病最主要的区别在于增生的滑膜细胞紧密附着于软骨上，这样释放的侵蚀骨质的各种基质蛋白酶很难与关节液中大量的抑制因子发生作用。   
' t: `/ q2 ]/ [- C0 y      对滑膜-软骨/骨交界处是关节破坏的“热区”(hot zone)的认识，促进了组织蛋白酶抑制因子的发现。如 Fluorokeones，不仅抑制体内组织蛋白酶B和L的活性，而且当给关节炎实验动物模型口服时，可以减少关节的破坏。对胶原酶的抑制剂也进行了类似的实验。Chloro-taunne，一种中性粒细胞在氧化爆发中产生的氯胺，可以减少细菌胶原酶降解胶原的能力。   
      在RA滑膜组织中还存在另外一个拮抗分子家族，基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)。TIMP的mRNA和蛋白主要在滑膜的衬里层表达，但是不局限于滑膜中。细胞因子如 IL-1和 TNF-α不影响 TIMP的基因表达，但是IL-11可以显著减少滑膜细胞和软骨细胞中TIMP的产生。尽管对TIMP在RA表达的特异性调控和功能还知之甚少，但是TIMP很可能是抑制软骨降解的靶向分子。
      总而言之，Fassbender首先描述了滑膜细胞转化后的外观，近来被描述为滑膜血管翳细胞，这种间充质来源的滑膜细胞表达VCAM-1,并且由多种原癌基因构成网络相互作用。

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类风湿关节炎的病程进展综合体现了炎症、滑膜组织增生、自身免疫三种病理生理过程。异常增生的滑膜组织侵蚀周围肌腱、韧带、软骨及骨，造成关节进行性破坏、畸形，最终出现不同程度的功能障碍。目前，围绕类风湿关节炎的发病机制，存在T细胞依赖和非T细胞依赖两种不同途径与假说。
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: ?4 L: I" ^1 x# O8 Y6 ]   一、T细胞的作用   
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      所谓T细胞依赖，是指有一些证据表明，在RA的关节滑膜组织中有许多单核细胞浸润，其中T淋巴细胞占据主要部分，并形成淋巴滤泡样的结构。这些淋巴细胞中大多数为CD4+和CD45RO+的记忆型辅助性T细胞。特定类型MHC II类分子的多态性决定了RA疾病发生的相对危险性，提示T细胞在类风湿关节炎的病情进展中发挥重要作用。家族和群体的连锁分析表明，大多数 RA病人优先表达一定类型的HLA-DRB1等位基因。一些HLADRB1等位基因位点决定 RA的危险性，如HLA-DRBI * 0401, 0404 , 0405和 0408，还包括HLA-DR4以外的基因位点如HLA-DRB1 * 01,1402和10。所有的与RA相关的 HLA-DRB2等位基因都在其第三超变区(HVR)拥有一段相同的序列。分布在HLA-DRB1 70～74位点上的氨基酸序列QK/RRAA是关键的遗传决定元件。然而，RA与HLA之间的相关性是不完全的，将近1/4的RA病人不携带DRB1的上述易感决定簇。这提示其他的易感或者修饰基因(HLA或者非HLA)和/或环境因素间共同决定了RA的发生。近来的研究表明，HLA-DR分子可能作为RA的病情进展因素而非始发因素发挥作用。因为RA倾向于发生在同时有两种 RA易感的HLA-DRB1等位基因的个体，所以MHC在细胞表面表达的密度可能与疾病的发生有关，而且RA病情的严重程度与HLA-DRB1等位基因的遗传负荷密切相关。大多数携带单拷贝HLA-DRB1 * 04 RA病人病情表现中等程度，同时带有两个易感基因的单体型病情就比较严重，易并发关节外的疾病表现，尤其HLA-DRB1 * 0401的纯合子往往易于形成严重的多器官病变。总之，HLA-DRB1似乎更可以被看作是反映病情程度严重与否的指标，它的阳性表现可能并非是决定 RA的始发因素，但一旦表现阳性，可以致使病情恶化。基因的剂量效应向这些基因的产物在抗原递呈中的作用提出了挑战。  
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      因为在抗原识别和递呈过程中，“三分子复合物”TCR-肽-HLA间相互作用的重要性，提示TCR的基因多态性与 RA可能存在一定的相关性，尤其对TCR与抗原-MHC间相互作用部位的基因位点分析引起越来越多的重视。但是，迄今为止，对 RA滑膜浸润T细胞TCR库的研究结果仍然是相互矛盾的。

   二、滑膜细胞的作用

     “类风湿关节炎是由T细胞介导的疾病”这一假说并非没有受到任何挑战和质疑。实验研究发现，在 RA中浸润于关节滑膜局部的T细胞表现为在多克隆背景上的寡克隆扩增，即在同一个病人的不同关节中经常发现同一T细胞克隆表型或者几个主要的T细胞克隆，提示在滑膜组织中可能存在针对共同抗原的 T细胞寡克隆扩增。RA关节浸润的大部分T细胞处于无功能活化状态，主要表现在绝大多数T细胞表面IL-2R(一)，在RA的滑液中几乎检测不到T细胞特异性细胞因子(IL-2,IL-3,IL-4, IFN-γ,TNF-β等)，这表明RA的关节炎症局部T细胞并未明显活化。另外，针对RA的免疫抑制药物不能有效的终止病情发展，只能起到暂时缓解作用。这些都是T细胞依赖机制不能合理解释的，同时提示非 T细胞依赖机制的存在。

* Y" `; @' H6 ?5 {( D8 P      类风湿关节炎的发生与发展过程中，具有转化特性的成纤维样滑膜细胞中原癌基因的过度表达、生长因子的产生及基质降解酶类的过多生成在关节破坏过程发挥着重要作用。事实上，越来越多的证据表明具有转化特性的滑膜细胞参与关节软骨和骨破坏是类风湿关节炎的特征性表现。  

& w2 ]( k# I+ J+ C" b/ y      1985年，Fassbender首次提出类风湿关节炎滑膜细胞具有转化细胞特征，其后实验发现其转化特性的依据包括:   

      (1)类风湿关节炎滑膜衬里层细胞由正常的1～3层增厚达到 10层以上，滑膜异常增殖类似于局限性侵袭生长的肿瘤，造成关节破坏(彩图17一4)。
& d" T  d5 k' s0 ?( w& J1 ]7 n; A
, j. m0 C, ?* R/ S& H      (2)类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞体外培养过程中丧失接触性抑制，可形成肿瘤细胞样的癌巢(foci)。随着传代次数增多，该特性逐渐丧失，但是可以通过加人外源生长因子如PDGF,EGF等刺激恢复。电镜观察FLS核大、苍白、核仁突出。
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      (3)类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞可以在非贴壁情况下以克隆形式生长。  

, d8 L! R5 s9 _, ?; C      (4)70%类风湿关节炎病人滑膜中可以原位检测到ras、c-myc等原癌基因的高表达。原癌基因在调控细胞增殖、分化过程中发挥重要作用，ras转化的成纤维细胞可以自行分泌组织蛋白酶(cathepsin B )，降解II ,IX,XI型胶原。原癌基因的过度表达可能使RA FLS逃避正常生长调控机制出现过度增殖，并获得侵袭特性。  

      (5)类风湿关节炎病人滑膜组织存在抑癌基因P53突变型的高表达，可能导致成纤维样滑膜细胞凋亡抑制，并出现过度增殖状态。  

; p% L: j$ Q0 ~" @; S' C      (6)酪氨酸磷酸化在正常细胞中比例很小，仅占0.3%，但与细胞的生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节。转化细胞中蛋白质酪氨酸磷酸化含量增加可以达到10～20倍。原癌基因突变为癌基因后，蛋白酪氨酸激酶活性大大增加。孙铁铮等研究发现类风湿关节炎 FLS酪氨酸磷酸化状态明显高于 OA FLS，约达4～6倍，为类风湿关节炎 FLS的转化特性提供了新的实验证据。

      (7)细胞外信号调节性激酶(ERK)本身持续激活是细胞转化的重要特征。孙铁铮等研究发现，在基础状态(无任何细胞或生长因子刺激)下，RA FLS的ERK活化状态明显高于骨关节炎的FLS，从而为类风湿关节炎FLS的转化特性提供了另一佐证。   

: n) |3 {) t! c5 g/ c      (8)类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞与软骨共植人严重联合免疫缺陷小鼠体内60天后，仍然表现出侵蚀软骨的特性，而骨关节炎和正常成纤维细胞则无此特性。在c-fos转基因鼠中也发现类似病变，而没有T细胞的参与，这表明滑膜的异常增生和关节病变的产生可以是非T细胞依赖性的。Firestein发现长期培养的RA FLS侵袭人工基质程度4倍于正常成纤维细胞。  

      一些动物模型为关节破坏途径的研究提供了线索。研究最透彻的动物模型是MRL/lpr小鼠。在同卵动物中，单个基因(lpr)的突变导致严重的自身免疫病，这些小鼠形成淋巴细胞增殖型疾病，产生很高的RF，与RA极其相似。有趣的是，该小鼠疾病的始发过程是与人RA相似，主要为成纤维样滑膜细胞表现出转化特性，其后增生的滑膜细胞附着于软骨和骨表面发生侵蚀。这些细胞中与增殖相关的原癌基因ras和myc也参与组织蛋白酶B和L及胶原酶的表达。令人奇怪的是，在这一阶段中缺乏炎性细胞。当关节软骨破坏发生以后，炎性细胞才出现在滑膜组织下层，与人RA很相似。这些动物模型的基因突变位点为fas凋亡基因。lpr的突变是内源性逆转录病毒基因的反转座子插人fas基因所致。   

      一例长期患有RA的患者感染HIV后，虽然CD4+阳性细胞缺乏，但是仍然表现出进行性的关节破坏。关节侵蚀破坏与滑膜细胞在局部产生过多的组织蛋白酶有关。更奇怪的是，受损关节局部没有炎性表现，可能是由于缺乏T细胞源性细胞因子所致。这些资料表明RA在非炎性的条件下，存在非T细胞依赖途径，即由成纤维样滑膜细胞介导的关节破坏。

      以上结果表明，RA成纤维样滑膜细胞发生不可逆的转变，即使在脱离炎性环境的条件下，仍可以保持持续的活化状态，表现异常增殖和侵蚀特性而不需要外源性刺激。非T细胞依赖途径在RA的病情进展中发挥着重要作用。RA成纤维样滑膜细胞既可以因为基因改变获得转化特性而主动侵蚀软骨和骨，又可以在各种细胞因子及生长因子作用下加强增殖和侵袭性。在 RA的疾病进展过程中，FLS既是“被动反应者”，又是转化后的“主动人侵者”。
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' X  |( c$ b7 s7 M/ C& `$ R      按照美国风湿病学会的诊断标准，当明确诊断类风湿关节炎时，软骨的破坏和炎症反应已经发生，也就是说RA FLS已经处在疾病不断进展的恶性循环中。因此，目前针对 RAFLS原代细胞或者细胞系转化特性的研究就像是考古一样，只能通过对化石的分析寻找原始转化环节留下的痕迹。   
: Y6 [6 J' A( q$ t
( w% m: C6 y( j' |& w/ y, H. n      以基质金属蛋白酶( matrix metallopro-teases, MMPs)为例，MMP-9和MMP-2在类风湿关节炎软骨及骨破坏过程中发挥重要作用。RA FLS可以持续表达MMP-9，而正常成纤维细胞和胚胎成纤维细胞则不能分泌MMP-9。体外培养的RA FLS在2～8代后，随着传代的增加MMP-9的水平下降，晚期FLS可以在IL-1β、TNF-α和LT作用下刺激MMP-9分泌水平增加，且IL-1β、TNF-a和LT也可以诱导正常成纤维细胞表达MMP-2和MMP-9。   

* c! F- t; @& o1 x5 M" q& W) @, @8 }      以往研究认为，RA FLS MMP-9的持续表达可能由于IL-1β和TNF-α等炎性细胞、生长因子作用的结果，并导致RA FLS具有侵袭特性的转化外观。但是，Uvenori EN研究发现，IL-1β诱导RA FLS分泌MMP-9和MMP-2所需浓度低于正常成纤维细胞所需浓度的10倍，这说明RA FLS对于IL-1β刺激更敏感;而且IL-lβ刺激正常成纤维细胞表达 MMP-2,MMP-9的最高水平明显低于RA FLS持续表达的水平。这表明除了IL-1β和TNF-α等细胞因子刺激外，尚有一种更复杂的机制导致MMP-9的产生，极有可能是细胞转化特性使RA FLS MMP-9表达增高。因为有研究表明，细胞永生化后，MMP-9的分泌水平明显增加，例如EGF可以刺激ras转染细胞MMP-9的产生能力明显高于未转染细胞。因此，MMP-9和MMP-2上述表达特点为 FLS在类风湿关节炎的病程进展中作为被动反应者和主动参与者存在提供了支持证据。Trabants等人认为RA I期病变是大量滑膜细胞异常增殖，伴以自主表达超早期基因(Immediately early gene)，促进MMP-9的表达，永生化成纤维细胞极可能代表RA早期特征。  
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      再如，IL-1β、TNF-a可以刺激RA FLS分泌IL-6,IL-8和PGE2等炎性因子，增强MMPs等蛋白酶类的产生和ICAM-1与VCAM-1的表达，并能够促进 RA FLS DNA合成。孙铁铮、吕厚山等在实验研究中发现IL-1β和TNF-α在RA FLS中诱导蛋白酪氨酸磷酸化程度的瞬时增强，并同时激活MAPKs三条信号传导通路(ERK,JNK,P38 )，其中酪氨酸激酶在IL-1β,TNF-α激活P42MAPK/ERK、促进成纤维样细胞生长过程中发挥关键作用。进一步实验结果表明，在基础状态(无任何因子刺激)下，RAFLS的蛋白酪氨酸状态明显高于骨关节炎，而且RA FLS的ERK分子处于持续活化的状态。酪氨酸磷酸化是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节，而ERK本身持续激活足以促进细胞转化的发生。上述研究结果表明，RA FLS既具有转化细胞的酪氨酸磷酸化程度增高和ERK持续活化的特点，又可以在细胞因子刺激下进一步激活MAPKs通路，并导致蛋白酪氨酸磷酸化程度的进一步升高。这不但为 RAFLS作为被动反应者和主动参与者提供了新的佐证，而且揭示了RA FLS作为被动反应者和主动人侵者的生化与信号转导机制。   

+ j2 m7 g6 I* H* p5 [   三、滑膜细胞转化与T细胞介导免疫异常:“鸡生蛋还是蛋生鸡?”

1 I1 m5 Q$ D. U+ }( I8 i      围绕类风湿关节炎的首发环节，T细胞与滑膜细胞的生物学行为的改变究竟哪个在先呢?即在类风湿关节炎疾病发生与发展过程中，二者的关系究竟是“鸡生蛋还是蛋生鸡”呢?  
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, i% T, Y0 F* h0 J2 A7 }      在类风湿关节炎发病的始发病变的认识上，Hariss认为T细胞参与一期病变，然而T细胞在类风湿关节炎发病中作为始发因素还是促发因素尚无定论。有人提出滑膜细胞的转化可能是类风湿关节炎发病的首发环节，这在自主破坏性关节炎动物模型MRL-lpr /lpr小鼠中得到证实。此类小鼠的关节表现类似于类风湿关节炎关节软骨的破坏，另外其体内存在RF和II型胶原抗体。该小鼠关节炎的始发过程非常类似于类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的转化，其中在滑膜细胞侵袭关节骨和软骨的局部缺少炎性细胞(多形核白细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)，在初始骨与软骨破坏后，炎性细胞才出现于滑膜下层，并与类似于成纤维样滑膜血管翁样结构有关。MRL/lpr小鼠关节破坏与人RA的病理相似性促使进一步对参与关节破坏的滑膜细胞的转化特性进行深入研究。  
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      因为RA滑膜异常增殖且表达ras、 myc等癌基因与滑膜细胞的转化特性密切相关，人们努力在RA滑膜中寻找转化因子，尤其是逆转录病毒存在的证据。免疫组化证实，RA滑膜可以与HTLV- I(I型人类T细胞白血病病毒)p19和p24的抗体反应，但是同一病人却表现出HTLV血清阴性，因此推测RA滑膜中可能存在与HTLV- I组分交叉反应或密切相关的抗原。Steffen Gay在滑液致密的蛋白聚集物中发现病毒样颗粒，以后经免疫电镜证实，8例RA病人中有5例存在直径200nm、内含70nm核心的病毒颗粒，但是缺乏HTLV- I p19和p24的抗原决定簇。这些病毒颗粒与C型逆转录病毒颗粒极其相似，而与其他已知的逆转录病毒无相似之处。短期或长期培养的RA滑膜细胞中都存在锌指转录因子Z-225，同样提示逆转录病毒的存在，因为到目前为止，Z-225仅在HTLV- I和HTLV- II转化的细胞中才有表达。另外，近来研究表明，RA滑膜细胞具有逆转录酶活性。因此，极有可能存在目前还未知的逆转录病毒在RA的疾病发生中发挥重要作用。  
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3 M9 D9 O+ Z' R1 q7 s      可以提出这样一种假设:类风湿关节炎的FLS极可能首先因为至今未知的逆转录病毒作用发生细胞转化，作为一个“主动入侵者”，侵蚀关节软骨，导致II型胶原等自身抗原的暴露，从而引发自身免疫反应，又在炎性因子和基质降解产物的作用下，进一步加强类风湿关节炎FLS的增殖/侵蚀性，使其作为“被动反应者”，从而使类风湿关节炎的病程进人恶性循环。这一假说解释了RA关节破坏过程中两种主要的细胞过程:滑膜细胞增生及其T细胞依赖的免疫反应，并且与该病易感的遗传学基础相吻合;而且，它阐明RA滑膜细胞既可以因为细胞转化，又可以由异常的体液及细胞免疫反应导致原癌基因表达的上调。有趣的是，在HTLV的转基因小鼠中表现出类似于RA的炎性关节病变。HTLV的反式活化蛋白tat和 tax可以诱导在类风湿关节炎中发挥重要作用的基因表达，其中包括c-fos, GM-CSF , c-sis(编码PDGFβ链)和MHC- II类基因。同时，该学说解释了为什么目前的抗类风湿治疗措施在制止病情进展作用上是如此局限。

7 S! l! V, \7 u: z      尽管如上推测尚需要进一步的实验证实，但是已有研究表明，类风湿关节炎T细胞的寡克隆扩增更可能缘于局部抗原所引发的反应。这项研究结果为上述假说中T细胞针对局部抗原发生反应提供了直接证据。从自身免疫性甲状腺炎的研究中得到的证据进一步支持这一观点:在此类患者的甲状腺内，存在T细胞受体V基因限制性表达，大部分T细胞与甲状腺局部抗原发生反应。虽然RA滑膜T细胞尚未发现存在上述特异性，RA关节滑膜中仅仅一小部分T细胞活化(如 IL-2R阳性的T细胞)，但是Londei等人从一例RA病人同一关节间隔21个月采集滑膜样本中分离建立的T细胞克隆中，约12%可以与II型胶原反应。类风湿关节炎中T细胞与II型胶原反应的特异性表位尚不清楚，从一健康个体分离出针对II型胶原的DR7限制性CD4+T细胞识别II型胶原分子αI链上的271～285氨基酸序列，而这一片段是目前惟一证明可以在动物模型中引起炎性改变的II型胶原片段。另外，RA及MRL-lpr /lpr小鼠关节破坏都发生在滑膜附着的局部，提示滑膜细胞与基质间相互作用的重要性。有关RA滑膜细胞与关节软骨和骨基质间附着分子及结构基础方面的研究引起越来越多的关注。实验证实，病变关节局部降解的胶原分子也可以调节RA FLS组织降解酶类的表达，这一认识导致以后研究发现部分降解的纤维连接素(非纤维连接素本身)与纤维连接素受体作用，诱导成纤维样滑膜细胞胶原酶和基质金属蛋白酶的表达。以上研究进一步支持这一假设:在类风湿关节炎软骨破坏过程中，滑膜细胞蛋白水解酶类的合成与分泌不仅仅由细胞因子调节，而且也可以由降解过程本身的产物所调控，两种机制对于 RA滑膜炎症的发展和软骨的破坏都是至关重要的。

      由上可见，成纤维样滑膜细胞的转化特性(异常增殖、侵袭性)不但在类风湿关节炎的病情进展中具有 T细胞依赖途径不可解释的重要作用，而且在类风湿关节炎始发环节的重要作用也引起越来越多的重视。成纤维样滑膜细胞的转化特性为揭示类风湿关节炎发生、发展的机制提出了一个全新的概念。  

' I# W2 r4 K) l4 E0 ?. Q. A7 k+ Z, e2 O    四、成纤维样滑膜细胞在RA发病机制中的临床意义   

      过去，就滑膜切除术对于类风湿关节炎的防治疗效究竟如何，英、美和欧洲大陆国家(除法国)的学者意见分歧很大。美国关节炎基金会、英国关节炎与风湿病委员会、英国骨科协会共同组成的一个联合调查委员会分别进行的对照研究结果认为，滑膜切除术对于类风湿关节炎病变的进展没有明显的终止和预防作用，关节功能的改善与否很大程度上取决于病情的进展，而与滑膜切除术的关系不大。但是在欧洲大陆，尤其是德语国家，人们对滑膜切除术所持的观点比较乐观。ERASS和风湿病矫形外科协会在这一问题上达成共识，他们认为“疾病的自然病程是影响滑膜切除术疗效的主要因素”这一观点是错误的。基于近20年的类风湿关节炎外科治疗的经验，著者原则上支持他们的观点，认为早期滑膜切除术可以延缓类风湿病变的进展，缓解全身症状，并有利于全身抗类风湿的治疗。分歧的原因固然与不同作者的手术方法、病例选择、术后处理、评价标准和随访时间等因素有关系，但其根本原因在于RA的发病机制至今仍不十分清楚。滑膜组织，包括各种滑膜细胞成分在类风湿关节炎疾病发生、发展中的重要作用尚未引起足够的重视。
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      经典的免疫学派认为，类风湿关节炎是机体对自身抗原发生的免疫反应，HLA亚型及TCR等位基因亚型共同决定了RA的遗传易感性。免疫复合物沉积于滑膜及T细胞参与的免疫反应导致滑膜细胞的异常增生，进而破坏关节周围肌腱、韧带、关节软骨和骨组织。根据此观点，滑膜组织与细胞的病理表现继发于自身免疫反应，作为“被动反应者”参与类风湿关节炎的自然病程，单纯切除滑膜组织难以根除自身免疫引发的全身反应，因此难以从根本上消除RA的病因，理论上对于类风湿关节炎病情的防治作用自然有限，而只有抑制免疫反应才能从根本上控制病情进展。因此，经典的免疫学观点无法圆满解释滑膜切除术对于类风湿关节炎病情控制的重要作用，更无法充分认识滑膜切除术的重要意义。认识滑膜切除术的重要意义关键在于对于类风湿关节炎发病机制的重新阐释，及对于成纤维样滑膜细胞转化特性在类风湿关节炎疾病发生与发展作用的重新界定。

      现在，滑膜切除术作为治疗早期类风湿关节炎的外科治疗手段已经逐渐被国外的内、外科医生广泛接受。国内的一些医生对此尚没有足够的认识，或由于患者在疾病早期对于手术治疗的依从性问题，以致于医患过分依赖保守的药物治疗，结果丧失早期控制病程进展的可能，关节组织破坏加剧，最后患者不得不选择人工关节置换术。吕厚山等基于多年风湿性关节疾病外科治疗经验，在国内率先提出RA治疗药物无效情况下应该早期实行滑膜切除术，并且根据前瞻性的临床随访研究确定，滑膜切除术的最佳时机为药物等保守治疗无效3～6月后。2000年美国骨科医生年会关于膝关节炎的非关节置换治疗的介绍中，改变过去的观点，主张对于RA内科药物治疗无效4～6月后积极早期实行滑膜切除术，这说明欧美对早期积极实行滑膜切除术治疗类风湿关节炎，防止关节软骨进一步破坏已有了重新认识。Nakamura的临床观察也证实，对于反复发生的类风湿关节炎实行滑膜切除术具有缓解全身病情作用。目前，以成纤维样滑膜细胞为靶向的基因治疗在德国和美国匹兹堡大学分别同时进行。针对IL-1Ra的基因治疗已经取得很好的疗效，这是人类第一次在恶性肿瘤以外的非致死性疾病中进行基因治疗研究，被誉为“生物遗传手段的滑膜切除术”。  

8 k. R/ i; M! |+ P* [+ M# F      总之，成纤维样滑膜细胞的转化特性为揭示类风湿关节炎的发病机制提出了一个全新的概念，针对滑膜组织及细胞在类风湿关节炎疾病发生与发展中的重要作用所取得的实验研究进展，以及临床上以成纤维样滑膜细胞为靶向治疗类风湿关节炎的相应措施所取得的良好效果，进一步为早期实行滑膜切除术提供了实验基础和理论依据。                             
                                                                                                                                                                    ( 孙铁铮 )
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