23-第23章 有身免度性肝病相关自身抗体

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目录：
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" r* U1 Y. Y3 e  m- ?& g第一节 概 述

4 M7 T, ]- b( n7 B第二节 抗核抗体
1 I# j/ L, z  ~% a7 }  R8 D' p& }1 u
$ P# J  j# p* L7 [+ ~  P5 y8 r第三节 抗平滑肌抗体
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第四节 抗肝/肾微粒体抗体

第五节 抗肝细胞胞质抗原1型抗体
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, v" |0 B( ]8 a* @" `第六节 抗肝-胰杭体与抗可溶性肝抗原抗体
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第七节 抗去睡液酸糖蛋白受体抗体

4 M4 U& Q0 }& ?# |# K第八节 抗线粒体抗体
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第九节 抗中性粒细胞胞浆抗体

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自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases)主要包括三种与自身免疫密切相关的、以肝胆损伤为主的疾病:自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC). AIH是一种伴循环自身抗体和高免疫球蛋白血症、病因未明、呈慢性炎性坏死的肝脏疾病，PBC是以自身免疫介导的肝内胆管损伤、以后呈肝纤维化、最终导致肝功能衰竭为特征的一类病因不明的自身免疫性肝脏疾病，PSC是一种原因不明的慢性综合征，其特征是肝外和/或肝内胆管弥漫性炎症及纤维化所引起的慢性胆汁淤积症。一般认为，自身免疫性肝病好发于欧美白人。据文献报道，AIH在西欧和北美患病率为0.1～1.2/10万人，占所有慢性肝炎的20%左右，PBC在西方国家患病率为10～20/10万人，PSC在欧美地区患病率至少为2～7/10万人，其中70%左右的患者合并有溃疡性结肠炎。   
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      近年来，国际上对自身免疫性肝病基础与临床的研究高度重视，并且进展迅速，主要涉及自身免疫性肝病的发病机制、遗传背景、相关自身抗体及其靶抗原性质、临床流行病学、临床诊断及治疗和预后等方面。   

' T5 J2 B  K% T; M8 o' X7 A0 w      自身免疫性肝病的诊断主要依靠病史、临床表现、体征和实验室检查结果。肝组织病理学检查被认为是AIH, PBC诊断的“金标准”，但此项检查临床应用具有局限性，例如，自身免疫性肝病的肝活检组织病理学表现特异性不强，非自身免疫性肝病所特有;患者不愿或不适接受此项创伤性检查;此外，目前多数医院采用B超引导下细针穿刺取材进行肝组织病理学检查，此检查受取材标本局限，是否能取得病变组织，对检查结果影响很大。尽管如此，肝组织病理学检查对自身免疫性肝病诊断、鉴别诊断及病变程度的判断至关重要，仍是诊断的重要标准之一。AIH,PBC早期病变(胆管炎期、慢性胆汁淤积期)属临床治疗可逆转期或可部分逆转期;而后期或终末期(肝纤维化/肝硬化期、肝衰竭期)属临床治疗不可逆转期，愈后不佳。因此，早期诊断、早期治疗尤为重要。自身免疫性肝病发病机制与免疫功能异常密切相关，自身抗体在发病机制中起重要作用。每种自身免疫性肝病都具有特征性自身抗体谱，自身抗体检测对自身免疫性肝病的诊断、分型及鉴别诊断具有重要意义。近年来，国外对自身免疫性肝病相关自身抗体谱靶抗原性质、临床诊断应用价值(尤其是无症状期的早期诊断)、与疾病临床特点及活动性的关系等方面研究进展迅速，有关自身抗体谱的研究已引起临床高度重视，自身抗体检测已成为自身免疫性肝病临床诊断的常规检查项目。   

      过去认为，自身免疫性肝病在亚洲黄种人中患病率较低，但近年来日本对自身免疫性肝病进行的大量研究结果表明，情况并非如此。日本厚生省难治性肝病调查组于1990～1996年进行了全国性临床流行病学调查，研究结果显示，日本人中AIH并不少见。PBC在日本亦不是少见病，至1997年全国累积病例报道达6000例，发病率为5.16/10万，近年发病有上升趋势。在我国过去认为自身免疫性肝病是一种少见病，有关自身免疫性肝病的基础研究、流行病学研究及临床研究报道非常少见。可能的原因是我国病毒性肝炎的发病率占有绝对高的比率，其次是自身免疫性肝病诊断标准中的重要因素——血清自身抗体谱检测很不普及，严重影响了该病的诊断和治疗。近年来，由于临床经验的积累和实验室诊断技术的进步，发现我国人群中自身免疫性肝病患者逐渐增多。国内有关自身免疫性肝病的发病机制、相关自身抗体靶抗原、病例报道、临床病例讨论和临床病理分析的文章逐渐增多，以上的工作说明自身免疫性肝病在中国并不少见。   
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      肝脏疾病是危害我国人民健康的常见疾病之一。慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病患者超过3000万，每年还新增几十万，其中相当一部分人转为重症肝炎、肝衰竭或癌变。虽然病毒性肝炎仍占首要位置，但自身免疫性肝脏疾病也是重要病因之一。自身免疫性肝病是与自身免疫密切相关的特殊类型的肝病，是一种不经治疗则预后不良的疾病，易发展成肝硬化，预后较差。其诊断和治疗完全不同于一般的慢性病毒性肝炎，对免疫抑制疗法有良好反应，而用干扰素等治疗病毒性肝炎的方案，往往可使病情恶化。因此，自身免疫性肝病的准确诊断、正确治疗在临床上非常重要，对肝病诊断治疗水平的提高具有重要意义。   

      现将自身免疫性肝病相关自身抗体谱的靶抗原性质、检测方法及其在疾病诊断中的临床应用价值简述如下。

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抗核抗体(anti-nuclear antibodies, ANA)是自身免疫性肝病常见的自身抗体之一。ANA包含有几十种类型的自身抗体，可出现于自身免疫性肝病的ANA主要包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗核包膜蛋白抗体、抗核点抗体和抗着丝点抗体等，以上ANA在自身免疫性肝病的诊断、鉴别诊断和分型中具有重要的意义。有关自身免疫性肝病相关ANA的靶抗原性质、检测方法等，在抗核抗体谱等章节中已有阐述，以下仅重点介绍这些 ANA在自身免疫性肝病中的临床意义。

9 U  g/ S: b( t' x4 V   一、抗DNA抗体和抗组蛋白抗体   
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      ANA是AIH最常见的自身抗体之一，约有75%的AIH- I型患者 ANA阳性，而且在10%的AIH患者，ANA是其血清中惟一可检测到的自身抗体。但ANA并不具有诊断特异性，不仅可见于AIH，也可见于多种结缔组织病。ANA常与抗平滑肌抗体同时出现，两者同时出现的阳性率为85 %～90 %。AIH患者中出现的ANA，其免疫荧光的模式以均质型(彩图23一1)和斑点型为主，也可见核膜型、核点型、核仁型和混合型等，但免疫荧光的模式与临床没有关系。ANA阳性是肝细胞损伤的标志，但ANA并不具有直接致病性，ANA阳性患者其长期预后较好。AIH患者ANA抗体效价(滴度)一般为1:160以上，ANA抗体效价可能受遗传因素及主要组织相容性复合物(MHC )的影响，HLA DR4阳性患者的ANA抗体效价较高。   
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( S$ b& _: {4 S; S- e      在ANA阳性的AIH-Ⅰ型患者中，其特异性靶抗原抗体以抗DNA抗体和抗组蛋白抗体为主。抗 DNA抗体分为抗 ss-DNA抗体和抗ds-DNA抗体两种。抗 ss-DNA抗体在 AIH中的阳性率为 85%，约有半数的患者只有抗ss-DNA抗体而无抗 ds-DNA抗体。但抗 ss-DNA抗体阳性与AIH患者的临床表现、对糖皮质激素治疗的反应以及其他实验室检查(如HLA-DR3, HLA-DR4等)无明显关系，而且该抗体可见于多种结缔组织病患者中，因此，抗ss-DNA抗体的检测对AIH无临床和预后价值。抗ds-DNA抗体为SLE的特异性自身抗体，抗体水平的消长与疾病的活动性或严重程度密切相关。近年的临床研究发现，在AIH中也可检测出抗ds-DNA抗体。抗ds-DNA抗体常出现在ANA阳性的AIH-Ⅰ型患者中，对疾病可能具有预后价值。Czaja等应用ELISA法检测抗ds-DNA抗体，在AIH中的阳性率为34%。抗ds-DNA抗体阳性的患者对糖皮质激素近期疗效差。在抗ds-DNA抗体阳性患者中，HLA-DR4阳性率为84%，而HLA-DR3阳性率仅为6%，提示该抗体的出现可能有基因学的基础。此外，AIH同SLE患者中的抗 ds-DNA抗体存在一些差异。AIH患者中的抗ds-DNA抗体检测多用ELISA法检测，并同间接免疫荧光法(短膜虫法)检测结果无相关性，AIH患者中的抗ds-DNA抗体可能多为高亲和力的抗体。   

2 ?, h5 b! a9 d" B& @      AIH- I型患者中的抗组蛋白抗体，其特异性靶抗原以H3亚单位及核小体为主。早期研究提示，抗组蛋白抗体阳性的AIH患者具有发病者年龄轻、伴高水平的天冬氨酸转氨酶和HLA DR4阳性的特点较阴性患者多。抗组蛋白抗体检测对AIH的诊断及预后价值还未确定。
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- Z) Z# y& G9 S3 C( _. r   二、核包膜蛋白抗体   

$ ?0 q  D: ]' l. z; f+ ?5 `- P      以HEp-2细胞等人源培养细胞为抗原底物，应用间接免疫荧光法进行ANA检测时，在自身免疫性肝病患者中常可出现纤细、光滑的核膜型荧光染色模型，其对应的自身抗体的靶抗原是位于核包膜结构上的蛋白，故此类自身抗体被称为抗核包膜(被)蛋白抗体(anti-nuclear envelop protein antibodies)(彩图23一2,3)。核包膜结构由核板、核膜和核孔复合物组成。核板是一直径10nm的中间丝状结构，与核内膜的内面连结，组成板层结构的蛋白，称为板层素(Lamins)，一般分为三型:A型(60kD),B型(68kD)和C型(74kD)，新近有报道存在D型。核膜分内膜和外膜，核内外膜借核孔膜连接，后者又与核孔复合物连接。核内膜的结构蛋白是核板层和染色质的附着部位，核板层 B受体(lamin B receptor, LBR)及板层相关多肽(LAP)等成分位于核内膜上。核外膜有核糖体及粗面内质网附着。核孔复合物为直径120nm、分子量 124kD的超分子结构，由80～100种不同的蛋白质组成。已有数种核孔复合物被分离、鉴定，其中包括与PBC密切相关的两种跨膜蛋白(gp210和p62蛋白)。对自身免疫性肝病的诊断具有重要临床价值的抗核包膜(被)蛋白抗体主要有:抗板层素抗体、抗核板层B受体(LBR)抗体、抗板层相关多肽(LAPS)抗体、抗gp210抗体和抗p62抗体。   
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$ i" R  P- t+ W* @5 G6 R+ c% l      抗板层素抗体(anti-lamins antibodies)又称抗核纤层抗体，根据所对应的靶抗原性质，分为抗板层素A抗体 、抗板层素B (B1和B2)抗体和抗板层素C抗体三种。抗板层素B抗体多见于合并抗磷脂综合征的SLE患者，报道的阳性率为6%～12%;阳性患者中表现为抗磷脂抗体和/或狼疮抗凝物异常者占47%;表现为血小板减少等抗磷脂抗体综合征症状者占17%。抗板层素B抗体检测有助于临床症状不典型的特殊类型的SLE的诊断。有文献报道，抗板层素B抗体在慢性疲劳综合征(chronicfatigue syndrome, CFS)患者中阳性率为52%.抗板层素A抗体和抗板层素C抗体，可见于PBC(6%～8%),AIH(9%～23%)等自身免疫性肝病患者中，并与疾病活动性密切相关。抗板层素抗体也偶见于类风湿关节炎、干燥综合征、硬皮病、血管炎和雷诺症等患者中。   
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# w% x$ h7 [* Z# y' b8 v! `      抗gp210抗体的靶抗原为位于核孔复合物上的 210kD跨膜糖蛋白，所识别的表位是gp210羧基末端上的15个氨基酸残基。该自身抗体被一致认为是PBC的高度特异性抗体。以gp210抗原决定簇的重组蛋白或合成多肽作为抗原，应用免疫印迹法或 ELISA法检测抗gp210抗体，其诊断PBC的特异性可高达96～99%，该抗体极少出现于AIH、类风湿关节炎、多发性肌炎、干燥综合征及非自身免疫性肝病患者中;其诊断PBC的敏感性为 10%～41%。约1/4(10%～40%)的PBC患者中，抗gp210抗体可与抗线粒体抗体(AMA)同时出现，抗gp210抗体也存在于20%～47 % AMA阴性的PBC患者中。对于临床、生化和组织学表现疑诊PBC而AMA阴性的患者，或AMA阳性而临床症状不典型、存在重叠综合征(如与干燥综合征重叠)的患者，抗gp210抗体检测有重要价值。抗gp210抗体与PBC患者的肝外临床表现具有一定的相关性，抗体阳性较阴性患者发生关节炎的几率增高。抗gp210抗体的存在及抗体滴度一般不随患者诊断的时间及临床过程而变化，但抗体阳性与阴性患者的预后有显著性差异，抗体阳性提示患者预后不良，抗gp210抗体可作为PBC患者的预后指标。ItohS等对一组 113例PBC患者进行研究，探讨抗gp210抗体与 PBC预后的关系后发现，抗gp210抗体阳性患者死于肝衰竭者明显多于阴性者，而诊断时两组间的黄疽及组织学分期无差异。   

+ u8 }* l2 n5 {2 T+ c& C/ U/ m      抗p62抗体又称抗核孔蛋白(nuclear pore protein ) p62抗体，其靶抗原为位于核孔复合物上的62kD跨膜蛋白。抗p62抗体为PBC另一高特异性自身抗体，在其他肝病或自身免疫性疾病中未检出，其敏感性为23%～32%。抗gp210抗体和抗p62抗体倾向于相互独立，一般不同时出现阳性。   

      抗核板层B受体(LBR)抗体的靶抗原为一种可连结核板层B的由60个氨基酸组成的核内膜多肽蛋白，抗原表位位于核包膜区核胞浆侧的抗原多肽蛋白的氨基末端区。抗LBR抗体为PBC的高特异性自身抗体，仅见于PBC患者中，但其敏感性极低，为 1%~3%。抗LBR抗体临床意义现还不清楚。   

      抗板层相关多肽(LAP)抗体的靶抗原为位于核内膜上的与核板层相连结的板层相关多肽(LAP)成分，分为LAP1和LAP2两种。有关抗LAP抗体研究报道较少。有一篇报道称，抗LAP2抗体在PBC中的阳性率为 16%;但抗LAP抗体可能是非PBC高特异性自身抗体，已有报道称，抗LAP抗体可见于多种自身免疫病及非自身免疫病中，如SLE、原发性干燥综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、抗磷脂综合征、慢性肝炎、神经炎和痛风等。有关抗 LAP抗体的靶抗原性质及临床意义有待于继续深入研究。   
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       虽然约25%的自身免疫性肝病患者抗核包膜蛋白抗体阳性，其中包括抗gp210抗体等高特异性自身抗体，但该自身抗体谱靶抗原特异性抗体的检测，仍未应用于临床常规检测中。文献报道抗Lamin/LBR抗体的核膜型荧光染色模型表现为光滑边缘型，而抗gp210抗体则表现为点状边缘型的核膜型荧光染色模型。但ANA检测出现核膜型荧光染色模型时，从细胞的荧光染色模型形态上仍很难区分是抗板层素抗体，还是抗gp210抗体或其他抗核包膜蛋白抗体。应用聚焦或数字减影技术可能有助于荧光染色模型区分、鉴别，但检测设备昂贵，不适于临床常规检验。随着分子生物学技术的推广，以重组蛋白或合成多肽作为抗原，通过免疫印迹法或ELISA法检测抗核包膜蛋白特异性自身抗体，将会广泛应用于临床常规检测。抗核包膜蛋白靶抗原特异性抗体的检测，对自身免疫性肝病患者的诊断及鉴别诊断具有重要的临床意义。
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   三、抗核点抗体   

4 N: x9 w! T8 |# O' I       以HEp-2细胞等人源培养细胞为抗原底物，应用间接免疫荧光法进行ANA检测时，可出现两种核点(nuclear dots, ND)型荧光染色模型:少核点型(a few nuclear dots)，又称抗p80螺旋蛋白抗体;多核点型(multiple nuclear dots, MND)，又称抗Sp100抗体。近年来，有关于抗核点抗体的研究表明，抗p80抗体和抗Sp100抗体与PBC等自身免疫性肝病关系密切，尤其是后者，可能是PBC的一种特异性抗体。抗核点抗体检测，对抗线粒体抗体阴性的PBC患者的诊断具有重要意义。   
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      抗p80螺旋蛋白抗体的靶抗原为与细胞核核浆中螺旋蛋白小体(coiled bodies, CBs)相关联的80kD核蛋白，靶抗原蛋白颗粒中含有小核糖核蛋白(snRNPs)成分。抗p80螺旋蛋白抗体可出现于自身免疫性和病毒性肝病患者中，如PBC、慢性活动性肝炎等;也偶见于其他种类的自身免疫病患者中，如干燥综合征、系统性红斑狼疮等。有关该自身抗体靶抗原的性质、功能及对PBC等患者的诊断价值，有待于进一步研究。   
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      近年研究表明，有两种核蛋白抗原的抗体应用免疫荧光法进行 ANA检测时，表现为多核点型(MND)的荧光染色模型(彩图23一4)。一种被称为抗Sp100抗体，其靶抗原为分子量100kD的可溶性酸性磷酸化核蛋白(Sp100);另一种被称为抗PML抗体，其靶抗原为异常表达于前髓(早幼粒)白血病细胞(promyelocytic leukemia cell, PML)的蛋白。抗Sp100抗体对PBC患者具有较高的敏感性和特异性，在PBC患者中的阳性率为10%～30%，其他肝病患者均为阴性。抗Sp100抗体亦可见于风湿性自身免疫病患者，但阳性率低(一般<3%)，不过抗体阳性者多与PBC密切相关，并在临床上常出现于肝损伤之前，如原发性干燥综合征、硬皮病等。抗Sp100抗体在AMA阴性PBC患者中的阳性率(60% )显著高于AMA阳性者(20%),该抗体对AMA阴性的PBC患者的诊断具有重要意义。抗PML抗体亦多见于PBC患者中，约90%的PBC患者可同时检测到抗PML抗体和抗SPIN抗体，两者具有相同的敏感性和特异性 。
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9 H' x* E3 N: U* J, ~; [% X   四、抗着丝点抗体   

      抗着丝点抗体(anti-centromere antibodies,ACA)是系统性硬化的亚型CREST综合征的特异性抗体，该自身抗体的靶抗原性质、检测方法及临床意义参见抗核抗体谱相关章节中。PBC常与系统性硬化(systemic sclerosis, SSc)重叠，发生率约 10%～15%，可表现出自身免疫结缔组织病不同的症状。ACA可见于PBC患者中，阳性率为 10 %～20 %。ACA阳性的PBC患者常同时存在CREST综合征的临床症状，如雷诺现象、指(趾)硬皮病等。   

       PBC患者中ACA的靶抗原性质同SSc，以着丝点蛋白B(CENT-B, 80kD)为主。应用 IIF检测时可以发现，PBC患者中ACA阳性常伴PBC其他相关自身抗体，最常见的是抗线粒体抗体(AMA),PBC患者中约20 % AMA阳性同时伴ACA阳性。ACA伴抗核点抗体、抗核包膜蛋白抗体(彩图23一5)的荧光染色模型也可见到。多种PBC相关自身抗体同时出现，可增加对PBC诊断的特异性。

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1965年Johnson等应用IIF法，以不固定的大鼠胃冰冻切片为抗原底物片，在慢性活动性肝炎患者血清中首先发现抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibodies, SMA或ASMA )。SMA无器官及种属特异性，主要为IgG和IgM类型。高滴度的SMA对I型自身免疫性肝炎(狼疮样肝炎)有重要的诊断意义，可与SMA阴性的 SLE相鉴别。SMA的靶抗原种类丰富，主要为多种细胞骨架成分，可分为肌动蛋白(actin)和非肌动蛋白两大类。肌动蛋白可以单体(G-actin)及聚合体(F-actin)形式存在于微丝( microfilaments)中。其中抗 F-肌动蛋 白(46kD)自身抗体与AIH关系密切，为AIH特异性自身抗体，而抗G-肌动蛋白自身抗体则与酒精性肝硬化有关。非肌动蛋白类靶抗原包括波状纤维蛋白或称波形蛋白(vimentin )、结蛋白或称韧带纤维蛋白(desmin )、微管蛋白(tubulin)、肌球蛋白(myosin)、原肌球蛋白(tropomyosin)和肌钙蛋白(troponin)等。非肌动蛋白自身抗原与某些感染性疾病、系统性自身免疫病等有关。

   一、检测方法   

" N# {4 ^- Y+ E/ r" y      目前SMA临床常规检测方法为 IIF法，实验基质最常选用鼠(大鼠或小鼠)或猴胃冰冻组织切片(不固定或轻度固定)。为提高IIF法检测SMA的敏感性和特异性，可选用复合组织抗原基质片(胃、肾、肝复合组织冰冻切片)检测，观察结果时应注意 SMA在不同组织抗原底物的荧光染色特点(彩图23一6)，可排除非特异性结合荧光及其他自身抗体(如常见的抗网硬蛋白抗体)的干扰。在ANA常规检测中，如HEp-2细胞出现细胞骨架纤维染色，应进一步应用胃组织等抗原基质片确认是否存在SMA。抗F-肌动蛋白抗体为AIH- I型的特异性抗体，已有实验室以经长春花碱(vinblastine)处理后培养的成纤维细胞为抗原底物，应用IIF法检测抗肌动蛋白抗体;也有以提纯或重组的肌动蛋白、或多聚体F-肌动蛋白为靶抗原，应用ELISA法或IB法检测抗肌动蛋白抗体或抗F-肌动蛋白抗体。以上实验方法可提高SMA对疾病诊断的特异性，提高其临床应用价值，但目前尚未广泛应用于临床常规检测。如HEp-2细胞出现肌动蛋白型荧光染色(表现为贯穿细胞的直的细胞骨架张力纤维染色)，同时其他组织平滑肌成分表现为强阳性特异性荧光染色(彩图23一7)，则 SMA为抗肌动蛋白抗体的可能性大，对AIH-Ⅰ型的诊断有很大帮助。
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$ h$ p8 V6 R. Y4 x0 W) J二、临床意义   
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SMA可见于多种肝脏疾病及非肝脏疾病，无疾病诊断特异性;但SMA对AIH-Ⅰ型的诊断有重要意义，高滴度的SMA ( > 1 : 160)对AIH诊断敏感性相当高(至少90%)，高滴度的SMA还可见于AIH与PBC重叠综合征患者。以F-肌动蛋白为靶抗原的SMA是AIH特异性抗体，其阳性率高达97%。而低滴度的靶抗原为非肌动蛋白的SMA(以IgM为主)，可非特异性出现于某些感染性疾病、系统性自身免疫性疾病及炎症性肠病等多种疾病中(表23一1)。
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1973年Rizzctto等应用IIF法，在慢性活动性肝炎患者血清中，首先发现同鼠肝细胞胞浆、近端肾小管上皮细胞胞浆反应而不同远端肾小管上皮细胞胞浆反应的抗肝/肾微粒体抗体(anti-liver/kidney microsomal antibodies，抗LKM抗体)。随后研究发现，抗LKM抗体包括三种与微粒体酶细胞色素P450反应的亚型抗体:①抗肝/肾微粒体1型抗体(抗LKM-1抗体)，为AIH- II型标记抗体，其靶抗原是细胞色素P450 II D6 (CYP2D6 )，主要是分子量为50kD的微粒体抗原结构表位。抗LKM-1抗体能够抑制CYP2D6的生物活性，促使肝内T淋巴细胞的浸润。部分CYP2D6靶抗原与丙型肝炎病毒(HCV)和单纯疤疹I型病毒具有相同的抗原性，丙型肝炎病毒或单纯疱疹Ⅰ型病毒感染的患者亦可能检测出抗LKM-1抗体。在慢性丙型肝炎患者中约2%～10%可检测到抗LKM-1抗体。②抗肝/肾微粒体2型抗体(抗LKM-2抗体)，仅见于应用药物替尼酸(tienlic acid)治疗后诱发的肝炎，其靶抗原是细胞色素P450 II C9 (CYP2C9 )。替尼酸是一种具有肝细胞毒性的药物，1980年美国FDA已禁止在临床使用，故抗 LKM-2抗体在临床已不存在。③抗肝/肾微粒体3型抗体(抗LKM-3抗体)，主要见于丁型肝炎病毒(HDV)感染患者，也见于少数AIH- II型患者。抗LKM-3抗体靶抗原是尿嘧啶二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase, UGT)，一种55kD蛋白。抗LKM-3抗体识别的是UGT-1, UGT-1是一种跨膜蛋白，暴露在内质网膜腔中，与药物代谢有关。检测抗 LKM抗体对AIH诊断、分型具有重要意义。
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0 g* M3 d0 m# j  o# w9 E" Q   一、检测方法  

4 M5 F* @/ G) o. |; q* }      IIF法常用于临床常规抗LKM抗体检测筛选试验，其临界值一般在1:20以上。IIF法检测抗LKM抗体实验基质常选用大鼠、小鼠或猴的肝和肾冰冻复合组织切片及灵长类睾丸的冰冻组织切片(彩图23一8,9)。抗LKM-1抗体荧光染色模型:肝组织肝细胞胞浆呈细颗粒到均质型的强阳性染色，肾组织仅近端肾小管上皮细胞胞浆染色，远端肾小管上皮细胞胞浆阴性或弱阳性，肾脏组织仅观察到部分肾小管有荧光，其他组织呈阴性反应。抗 LKM-2型抗体荧光染色模型:肝细胞或小叶中心肝细胞呈强阳性染色，而门脉区肝细胞呈阴性或弱阳性染色;肾组织近端肾小管近端三分之一段的上皮细胞常呈阳性显色。抗LKM-3抗体荧光染色模型:肝和肾组织均为阴性，灵长类睾丸间质细胞明显染色。
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      如果用IIF法检测抗LKM抗体，阳性者应进一步应用特异性抗原检测确认肝肾微粒体亚型抗体，检测方法包括IB, ELISA等。当然也可不用IIF法筛选，直接应用IB, ELISA法检测抗LKM特异性抗体。目前临床常规检测抗LKM抗体以检测抗 LKM-1抗体为主。
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" w- i! \7 w0 O0 w   二、临床意义

* v( t/ K/ Z3 O% r0 D- u* R      抗LKM-1抗体为AIH- II型血清特异性抗体，敏感性为90%，在AIH中检出率较低(约10%左右)。慢性丙型肝炎患者中约 2%～10%也可检测到抗 LKM-1抗体。AIH中抗LKM-1抗体阳性患者，较多具有典型的自身免疫现象，大多为青年女性，自身抗体滴度较高，血清免疫球蛋白显著增高，病情比较严重，对激素治疗反应好，欧美地区多见;HCV感染伴有抗LKM-1抗体阳性患者，大多年龄较大，女性并不多见，自身抗体滴度较低，血清免疫球蛋白不高，病情为慢性肝炎表现，对干扰素治疗有反应，地中海地区多见。   
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1 h( @- g1 }5 r  z7 o* U      抗LKM-2抗体仅见于应用药物替尼酸治疗后诱发的肝炎患者。由于该药物已停用，故抗LKM-2抗体已不存在。   
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      抗LKM-3抗体见于10%～15%慢性丁型肝炎患者，大约有10%的AIH-II型患者既有抗 LKM-1抗体，也有抗 LKM-3抗体。抗LKM-3抗体在AIH-II型患者中滴度较高，而在丁型肝炎患者中滴度较低。

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抗肝细胞胞质1型抗体(anti-liver cytosol antibody type 1，抗LC1抗体)或称抗肝细胞胞质抗原 1型抗体，被认为是AIH- II型的另一个标记抗体。1988年Martini等应用IIF法和ID法在 6例成人 AIH患者血清中首先证实抗LC1抗体的存在。靶抗原存在于肝细胞的细胞溶质中，其成分为亚胺甲基四氢叶酸环化脱氢酶(formiminotransferase cyclodeaminase)和精氨(基)琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase) , IB法检测表现为58kD～62kD的肝细胞胞液多肽蛋白。检测抗LCl抗体对AIH诊断、分型具有重要意义。
: L. L- {# Q2 Z) ^+ B
7 A  V' N- {3 M1 {# ?& b# m3 K( F   一、检测方法
( G/ z  j. {8 t$ E2 F1 Q% s) D
    抗LCl抗体检测方法包括 IIF, ELISA,ID, IB法等。IIF法常用于临床常规抗 LCl抗体检测筛选试验，IIF法检测抗LCl抗体实验基质与其他常见的自身免疫性肝病自身抗体所应用的实一验基质相同，即多选用动物器官(大鼠、小鼠或猴)肝、肾和胃复合组织冰冻切片作为抗原底物片(彩图23一10)。抗LCl抗体荧光染色模型表现为:肝组织肝细胞胞浆呈现均质荧光染色，肾组织则显示阴性。单独抗LCl抗体阳性，鼠(啮齿类)肝组织肝细胞胞浆呈现特异性荧光染色，而中央静脉周围区的2～3层肝细胞胞浆染色明显减弱，如抗LKM抗体与抗LCl抗体同时存在，应用 IIF法不易鉴别。现已有抗 LCl抗体ELISA检测商品试剂盒，包被的靶抗原是昆虫细胞中杆状病毒载体表达的亚胺(代)甲基转移酶-环化脱氢酶重组抗原，可定量检测。

   二、临床意义

5 d6 r7 j1 ~9 K1 l* I# n- ^+ X      抗LC1抗体为AIH-Ⅱ型的血清特异性抗体，阳性率为56%～72%。在临床上，抗LC1抗体多见于年龄小于20岁的年轻AIH患者，而少见于年龄大于40岁的AIH患者。抗LCl抗体常与抗LKM-1抗体同时存在，抗LCl抗体阳性的患者中，32%～67%可检测出于抗LKM-1抗体;抗LKM-1抗体阳性的患者中，25%～50%可检测出于抗 LCl抗体。故抗LCl抗体与抗 LKM-1抗体有密切的关系。HCV感染与LCl不相关，抗HCV与抗LCl抗体没有交叉反应，因此，抗LCl抗体对AIH的特异性要优于抗LKM-1抗体。抗LCl抗体与AIH- II型的疾病活动性具有相关性，为AIH的疾病活动标志及预后指标。

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1981年Berg等首先在慢性活动性肝炎患者中发现并报道抗肝-胰抗体(anti-liver-pancreas antibodies，抗LP抗体)，其后抗 LP抗体被许多学者证实为AIH高度特异性自身抗体，但抗LP抗体的靶抗原性质一直不明，可能是一种细胞溶质蛋白。经纯化的LP抗原不含细胞核、线粒体、微粒体及细胞骨架抗原成分，为非器官特异性可溶性蛋白质，对蛋白酶处理敏感，对补体具有较强的结合活性等，其分子量分别是52kD和48kD。

) J' M# Y3 D+ Z$ C  r6 {# g      1987年Manns等首先在非乙肝慢性活动性肝炎患者中发现并报道抗可溶性肝抗原抗体(anti-soluble livers antigen antibodies，抗SLA抗体)。该自身抗体在非自身免疫性肝病中不能检出，为AIH高度特异性自身抗体。可溶性肝抗原(SLA)可能是肝细胞胞浆溶质成分，不具有种属特异性和器官特异性，可分布于多种动物的多种器官组织中，但在肝脏、胰腺和肾脏等富含酶的器官组织中浓度最高。SLA对胰蛋白酶、糜蛋白酶敏感，而对DNA酶,RNA酶和神经氨酸酶抵抗，故SLA是一种蛋白质，其分子量分别是55kD和45kD。1990年Wachter等报道抗 SLA抗体的靶抗原为肝细胞胞浆中的细胞角蛋白(cytokeratins)8和18。细胞角蛋白是一组上皮细胞骨架蛋白，共有19种成分，在不同的组织中有不同的表达。肝内表达的角蛋白只有两种，即角蛋白8(分子量为52.5kD)和角蛋白18(分子量为45kD)，抗SLA抗体主要与肝角蛋白反应。1998年Wessierska-Gadek等报道抗SLA抗体的靶抗原为谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)的亚单位，GST的3个亚基Ya, Ybl和Yc是抗SLA抗体的主要自身抗原。   

      十余年的研究发现，LP和SLA的分子量、理化性质及相应自身抗体的临床意义有很多相似之处。目前认为 LP和 SLA是同一抗原，SLA/ LP抗原是分子量为50kD的细胞溶质分子，被称为UGA抑制物tRNA相关蛋白。抗LP抗体和抗 SLA抗体合称为抗 SLA/ LP抗体。2000年 Wies等首次从人肝组织、激活的人淋巴瘤细胞中成功地克隆出SLA全长。DNA序列，在 DNA水平上鉴定出抗 SLA/ LP抗体的靶抗原，并在大肠杆菌中成功表达。   
! S6 Y9 g4 y1 l7 L, c
      抗SLA/LP抗体的靶抗原参与selenprotein(一种UGA抑制物，tRNA相关蛋白)生物合成的调节，早期的研究也表明抗 SLA抗体有可能参与了对肝细胞的破坏，因此推测抗SLA/LP抗体与AIH的发病机制有关。

   一、检测方法   
3 [8 Z4 m8 X: Q/ h1 i
# `) \! }- o- W; _       抗SLA/LP抗体检测方法很多，包括RIA,ELISA,Western blotting等，但因SLA的性质、结构及生理功能一直不明确，抗SLA/LP抗体只能在少数实验室中进行用于研究目的的检测，未能广泛应用于临床常规检测。常规的IIF(以大鼠肝脏等为底物)不能检测出抗SLA/LP抗体，但以猴肝脏冰冻组织切片为底物的IIF，有时会出现特异性阳性荧光染色。荧光染色模型表现为猴肝组织肝细胞浆明显染色，呈细颗粒到均质型溶融状荧光染色。但该法检测抗 SLA/LP抗体的敏感性低，不能作为抗SLA/LP抗体的筛选实验。以人工纯化的天然SLA/LP为抗原的Westen blotting法，抗SLA/LP抗体阳性时可出现45～55kD(靶抗原为细胞角蛋白8/18)及26kD(靶抗原为谷胱甘肽-S-转移酶)等特异性条带。   

& r1 A( D% \2 M       2000年以后，随着Wies等对SLA的成功克隆、表达及其基因序列分析，多种以重组SLA/LP为靶抗原的抗SLA抗体诊断试剂已研制成功。现已有商业诊断试剂公司开发出多种以重组 SLA/LP为靶抗原的抗 SLA抗体ELISA(定量),Western blotting(定性)、斑点印迹(定性)、条带印迹(定性)等检测试剂盒。以上标准化的及操作简便的商品检测试剂盒的出现，会促进抗 SLA/LP抗体广泛应用于临床常规检测，对自身免疫性肝病的诊断及鉴别诊断有重要帮助。

5 x% y5 _- z5 D" v; ?   二、临床意义

       虽然AIH存在种类较多的自身抗体，但多数自身抗体并非AIH特异性抗体。抗SLA/LP抗体为少数公认的AIH高度特异性自身抗体，在AIH所有相关自身抗体中最具有诊断价值。抗 SLA/LP抗体在 AIH中的阳性率为10%～30%，该抗体多出现在ANA, SMA和抗LKM-1抗体阴性的AIH患者血清中。抗SLA/LP抗体为AIH- Ⅲ型的血清学标志，临床上常用于AIH的诊断和鉴别诊断。阳性患者多为年轻女性，多伴有高免疫球蛋白血症。约30%的AIH-Ⅲ型仅该抗体阳性，而缺乏所有其他自身抗体标志，但对免疫抑制治疗有效，抗SLA抗体测定对发现这一部分AIH患者有重要意义。

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1968年Morell等发现了去(无)唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR) ,最初人们称ASGPR为肝脏特异性膜脂蛋白(liver-specific membrane lipoprotein, LSP)。80年代初研究发现，LSP实际上包含了多种蛋白组分的复合物，ASGPR只是其中一种重要抗原成分之一。90年代初确定了ASGPR的氨基酸组成及其结构。ASGPR是一种肝特异性跨膜糖蛋白，含有大约10%的多聚糖，由40个氨基酸组成的N端残基位于细胞膜的内侧端，19个氨基酸段位于膜间，另232个氨基酸肽段位于细胞膜外侧端，面向肝窦。每个正常分化的肝细胞表面大约有50万个ASGPR分子。从人和动物LSP中分离的ASGPR具有肝特异性和种属特异性。ASGPR能够识别带有末端半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺基的糖链，并与之特异性结合，通过细胞内吞作用进入肝细胞，并在溶酶体内被降解清除。从20世纪90年代初开始，人们相继发现AIH患者血清中存在高水平的抗ASGPR抗体，并与疾病活动性密切相关。同时体外试验研究发现，AIH患者的淋巴细胞对纯化的人ASGPR的刺激产生显著的增殖反应，并从AIH患者的外周血及肝活检组织中筛选出ASGPR特异性 T细胞克隆。因此，ASG-PR及其自身抗体在 AIH的发病机制、诊断及治疗监测中受到广泛重视。   
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      同其他自身免疫性肝病的相关自身抗体的靶抗原相比，ASGPR的表达部位最具特殊性，属位于肝细胞膜表面的肝特异性蛋白成分，因此容易成为细胞免疫和体液免疫的靶抗原。这种器官特异性的受体分子介导了免疫反应，导致了特异性的器官损害。目前认为无唾液酸糖蛋白受体、细胞色素P-450 II D6等最有可能成为AIH的靶抗原。
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   一、检测方法抗

1 ?) I! |+ [7 N4 M; E      抗ASGPR抗体检测方法包括 RIA, EIA和IB法等，ASGPR抗原可从动物或人肝脏组织中纯化，但检测抗人ASGPR抗体较抗动物ASGPR抗体对AIH等更具临床特异性。因抗ASGPR抗体与肝脏疾病的炎症活动密切相关，定量检测尤其重要。现已有抗 ASGPR抗体ELISA商品检测试剂盒面市，该项自身抗体用于临床常规检测已无问题。

. O8 Y& i4 q" ?" |; U( b; y   二、临床意义

0 u, n4 Q( R* F  x( n1 p      抗ASGPR抗体对 AIH具有很高的特异性，阳性率为50%～88%，可与ANA, SMA或抗LKM-1抗体同时存在，可见于AIH每一亚型。抗ASGPR抗体亦可见于急慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、PBC,PSC和非肝病自身免疫性疾病等疾病中，阳性率一般低于15%，且抗体水平较低，多呈一过性(见表23一2)。抗ASGPR抗体最重要的特征及临床应用价值在于该自身抗体与肝脏炎症的活动程度密切相关，被称为AIH疾病活动性的“晴雨表”。对免疫抑制剂治疗有效的患者，抗ASGPR抗体降低或消失;而免疫抑制剂治疗无效者，则该抗体无明显变化;停药后复发的患者，该抗体则明显升高。此外，有学者报道在AIH-Ⅰ型患者中，抗ASGPR抗体阳性患者较阴性患者更易复发。   
0 y& w' w2 r" g  P


( g' w* m6 o" F8 |/ x. S$ H% ~- E      因此，抗ASGPR抗体除了可作为AIH诊断的特异性自身抗体外，还可将其作为判断疾病活动度、治疗监测及判断预后的指标。   
* e; ?( K0 }7 m  n$ s- F  W
/ @$ y9 N- r; h7 v* I% \8 o      Trerichel等比较了抗不同来源抗原的抗人、抗兔及抗鼠ASGPR抗体的临床应用价值。结果显示，抗兔或抗鼠ASGPR抗体可见于AIH、急慢性病毒性肝炎、酒精性肝病和 PBC等，但缺乏疾病特异性;而抗人ASGPR抗体则主要见于AIH，具有疾病诊断特异性。因此，临床常规检测的抗ASGPR抗体应是抗人AS-GPR抗体。

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1965年Wa1Rer等首次应用间接免疫荧光法(IIF)，发现原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者血清中存在抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibodies, AMA),其后研究发现，AMA是一种以线粒体为靶抗原、无种属和器官特异性的自身抗体，PBC患者中的AMA阳性率可高达95%，此项检测已成为PBC诊断的重要实验室指标。80年代初期，应用免疫印迹技术发现，PBC患者血清能与不同种系的多种组织细胞的线粒体自身抗原成分发生免疫反应，但对这些主要定位在线粒体内膜，对胰蛋白敏感的蛋白质的生化本质仍不清楚。1987年Gershwin ME等首次克隆出70kD线粒体自身抗原的cDNA，并测定了其氨基酸序列，此后证实所表达的融合蛋白是线粒体酶的亚单位丙酮酸脱氢酶复合物E2 (pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)成分。1988年Van de Water和Fussey领导的两个不同的研究组分别发现，PBC患者中AMA识别的靶抗原主要为 2-酮酸脱氢酶复合物(2-oxoacid dehydrogenase complex, 2-OADC)成分。现已证实，在线粒体内膜中归属2-OADC的丙酮酸脱氢酶家族包括三类:①丙酮酸脱氢酶复合物(PDC) ;②支链α-丙酮酸脱氢酶复合物(BCOADC) ; ③酮戊二酸脱氢酶复合物(OGDC)。上述三类酶复合物均属高度保守蛋白，由以下3种酶亚单位重复组成:①底物特异的脱羧酶;②二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2); ③二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。其中以E2亚单位复合物(PDC-E2 , BCOADC-E2, OGDC-E2)为靶抗原的自身抗体对PBC的诊断具有重要的临床意义。此外，E1和E3亚单位复合物的自身抗体对PBC亦有诊断价值(表23一3)。1995年Berg等根据在线粒体膜上存在的能与AMA反应的9种线粒体自身抗原，将AMA分为9种亚型(AMA Ml～AMA M9)，不同的亚型其临床意义存在差异，其中与 PBC最相关的是M2亚型抗体。应用生化方法从线粒体内膜中提取的被称为M2的线粒体成分，由5种抗原决定簇组成，其主要成分为PDC-E2，还包括PDC-E3BP、BCOADC-E2、PDC-E 1α及 PDC-Elβ等成分(表23一3)。除M2抗原外，在线粒体外膜还含有M4 , M8和M9等抗原亦与PBC密切相关(表23一4)。AMA亚型抗体检测极大提高了AMA对PBC诊断的敏感性和特异性。

6 C" d. }! ^! ]6 c$ Y8 r5 \
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4 c7 H; ^% o% Y, m3 m* |
, M/ w( Z# v3 V( h1 i  w7 T   一、检测方法   
& n. V0 e* k' o; S
# c1 G( e* n2 h! Q% {      AMA传统的最常用的检测方法是以动物组织(如鼠肾或肝/胃/肾复合组织等)为抗原底物的间接免疫荧光法(IIF)(彩图23一11)，该方法简便易行，但有其局限性: ①M4 , M7 , M8和M9等亚型抗原的抗体不能用 IIF检出;②易受与细胞浆线粒体外其他抗原成分反应的自身抗体干扰而出现假阳性，如抗核糖体P蛋白抗体(抗rRNP抗体)、抗 LKM抗体等;③敏感性、特异性低于以纯化的线粒体亚型成分为靶抗原的抗体检测方法;④不能分型，临床应用价值低于AMA特异性亚型抗体检测。目前，对PBC有重要诊断价值的抗M2 , M4或 M9亚型抗体已逐渐应用于临床常规检测，市场上有多种ELISA或免疫印迹法检测商品试剂盒可供选用。现多数实验室检测 AMA采用 IIF法进行初筛，AMA阳性再应用ELISA法或免疫印迹法进行分型，主要检测AMA-M2亚型抗体。因ELISA法或免疫印迹法检测的敏感性略高于IIF法，约5%的患者血清应用IIF法检测阴性，而用ELISA法或免疫印迹法检测则为阳性或弱阳性，故提倡 AMA检测时联合使用 IIF法和亚型抗原特异性的酶免法、免疫印迹法等，可以提高AMA临床疾病诊断的敏感性和特异性。

6 H- a% A8 g, Q, o0 a   二、临床意义   

9 |, t7 o& C7 I2 }      AMA为一组可同线粒体内膜或外膜上多种酶复合物成分相结合的自身抗体的总称。虽然应用传统的IIF法检测PBC患者血清中的AMA,敏感性可达90%以上，但 AMA也可出现于某些感染性疾病、结缔组织病及药物诱导性疾病患者中(表 23一4)。靶抗原特异性AMA亚型抗体的临床应用，提高了AMA对疾病诊断及鉴别诊断的临床应用价值。

      以线粒体内膜上的2-酮酸脱氢酶复合物为靶抗原的AMA M2亚型抗体，是PBC患者的高度特异性自身抗体，敏感性为 95%～98% ，特异性为86%～97%。有学者认为当AMA M亚型抗体高滴度时，确诊 PBC不再需要肝活检组织病理证实。PBC早期AMA常为低滴度，随着病情进展，AMA可逐渐升高，但其滴度高低与疾病严重度或预后并不相关。此外，一些线粒体外膜抗原的亚型抗体，如AMA M4,AMA M8和AMA M9也与PBC密切相关。抗 M4, M8 , M9抗体在PBC患者中的检出率相对抗M2抗体低一些，其中，抗M4抗体和抗M8抗体多伴抗M2抗体，抗M9抗体部分伴抗 M2抗体，部分可单独出现。有文献表明，AMA M4, AMA M8和 AMA M9与PBC患者的早期诊断及疾病预后有一定关系。

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抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody, ANCA)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。1982年，Davies等在8例节段性坏死性肾小球肾炎患者血清中首次发现了ANCA。现已发现，ANCA自身抗体谱存在十余种特异性抗体，ANCA对系统性血管炎、炎性肠病和自身免疫性肝病等疾病的诊断与鉴别诊断具有重要意义。ANCA已成为自身免疫病重要的临床常规检测项目(详见第22章)。ANCA是自身免疫性肝病标准诊断谱的最新成员，主要见于自身免疫性肝病中的AIH-Ⅰ型及 PSC患者中，而PBC患者则少见。自身免疫性肝病中出现的ANCA，其免疫荧光染色型为核周型 ANCA(perinuclear ANCA, pANCA)或非典型性AN-CA(atypical ANCA, aANCA或xANCA)。其特异性靶抗原尚未完全清楚，可能是肌动蛋白(actin)或位于核板层(lamina)的某些粒细胞特异性抗原成分，而不同于原发性系统性血管炎患者中ANCA所常对应的特异性靶抗原，如蛋白酶3 ( proteinase 3, PR3)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)等。
& u" r$ G# B0 ~% d# ]
   一、检测方法   

      因尚未完全清楚自身免疫性肝病中出现的ANCA所对应的特异性靶抗原，以肝胆损伤等症状为主的自身免疫性肝病患者，常规检测ANCA可只选用间接免疫荧光法，检测结果ANCA阳性免疫荧光染色型多为pANCA或aANCA。

9 O- N% x( x- D# d- O8 U; H  d   二、临床意义   

% m/ E! h& i+ v4 j* c      pANCA主要见于自身免疫性肝病中的AIH-Ⅰ型及 PSC患者中，阳性率分别为 65%～92%,29%～88%，而AIH- II型、PBC及其他非自身免疫性肝病患者中则少见。ANCA检测有助于自身免疫性肝病患者的诊断、分型及鉴别诊断，并可用于慢性隐源性肝病的分类。   
  h2 M- ^3 o; a* f4 q9 ]4 {: C6 E
+ I5 H( T5 d) T% PpANCA与AIH-Ⅰ型的疾病活动度(转氨酶和γ-球蛋白水平)相关，ANCA阳性患者的病情常较重。pANCA阳性的PSC患者，合并溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的可能性较大，亦与胆管树受累广度相关，病情往往较重。   
                                                                                                                                                               （李永哲 ）

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