14-第14章 糖蛋白和类风湿关节炎

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目录：
  v- v$ ]* z" p* V& U
1 z& ]; m, O# S0 i" @- @第一节 糖蛋白概述
3 D4 d& k0 a7 r4 ~1 ]: r" j% H6 J
$ G0 x& y3 _; p  G& ~* t. X第二节 免疫球蛋白与糖蛋白的关系

0 {" w. E$ H: _# L$ T2 g第三节 IgG糖链的正常结构
* E, O, e8 r- I/ T  ~; P2 g
" z( f2 F" q2 g, J3 D第四节 类风湿关节炎IgG糖链的变化
( c# V+ [/ P: ^7 F. V, G
第五节 血清IgG(0)水平与RA临床
, i" {/ k! j6 j% C" z
$ [1 E% e" W7 k5 L, a2 L3 S. x) d4 U第六节 IgG糖链变化与RA发病有关的问题

第七节 对类风湿炎发病机制的认识和研究新进展

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一、糖生物学概述  
      在20世纪 50年代早期，Francis Crick提出遗传信息沿着从 DNA到RNA到蛋白质的方向单向传递，即DNA产生RNA, RNA产生蛋白质，这就是著名的分子生物学的中心法则。此后该理论不断被完善，由此分子生物学有关蛋白质的研究取得了突飞猛进的发展。事实上，细胞的形成还需要两种重要的物质:脂类和糖类。它们可以作为产生能量的媒介，也可以作为信号分子，还可以作为结构组分。特别是糖类，在构成复杂的多细胞生物体方面尤其重要，因为这些复杂的多细胞生物体需要细胞和细胞之间、细胞和周围基质之间的相互作用。事实上，自然界中所有细胞和大多数大分子是依靠糖链组成复杂的结构体。  
  [4 ?% S: ]4 d" H% U      在二十世纪初，化学界、生化界和生物界就表现出对糖生物学的兴趣。但是，在分子生物学发展的早期，对多糖(glycans)的研究远远落后于对分子中其他重要成分的研究。这很大程度上与多糖内在结构复杂、难以测序、其生物合成不是直接利用DNA模板得到的有关。近年来，一系列新技术的发展为探索这些糖链的结构开辟了一条新途径。1988年，Rademacher、Parekh和Dwek提出将这门分子生物学中的新学科称为糖生物学(glycobiology)，他们用糖类在细胞分子生物学最新的观点认识它在化学和生化这两门传统学科中的内容。从广义上讲，糖生物学研究的是在自然界广泛存在的糖类的结构、生物合成和生物特性。糖类与其他种类的化学成分以共价键的方式组成各种类型的复合物被归类为复合糖(glycoconjugates)，它包括糖蛋白、糖肽、糖脂、肽聚糖、脂多糖等。   
     本章主要讨论糖蛋白和它在类风湿关节炎中的作用。
" Z- k, l9 ]* X2 S7 b0 d3 p二、糖蛋白的结构和功能  
      肽链通过共价键和寡糖链(或糖基)结合的蛋白质称为糖蛋白(glycoprotein)。寡糖[注]是由2～10个单糖单位通过糖苷键连接起来的，在糖蛋白中呈线形或分支状，分支状寡糖中至少包括20个单糖残基。糖蛋白中糖的含量差异很大，糖占糖蛋白分子重量的1%～85%。糖蛋白形成的过程称为糖基化(glycosylation)。
% a0 M, @" M. [$ t* a! K      糖蛋白是在生物体中存在的复杂糖类(糖缀合物)的一种。糖蛋白的存在很广泛，如人血浆中除了白蛋白之外，其他各种蛋白质都是糖蛋白，许多细胞膜蛋白也含有糖的成分，多种激素也是糖蛋白，糖蛋白中的糖链组成还与血型有关。此外，糖蛋白的糖链与肿瘤的细胞转移现象，与异体器官移植中的免疫排斥有关，由此可见糖蛋白不仅具有重要的生理学功能，而且对病理学变化以及诊断有重要意义。表14一1列举了糖蛋白的功能。
' H% J: Z4 d9 i: B( E& z/ Q; Y（ [注]：1996年在IUPAC-IUB有关生化命名的联合会议上，寡糖是这样定义的:寡糖是以单糖为单位，通过糖苷键连接的复合物。按照单糖的数量，它们可以被称为双糖、三糖、四糖等，因为多糖中单糖的数量限定很不严格，所以寡糖中单糖数量的上限没有明确规定，一般指相对于尚未明确长度的聚合体或相应的混合物，寡糖具有明确的结构。）


     许多研究证实了糖链在糖蛋白功能中的作用，认为寡糖链编码了糖蛋白的生物学信息，这主要与寡糖的成分、序列和构成有关。表14一2总结了寡糖链的各种功能，其中有的功能已经确定，有的还在进一步研究中。
   
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9 ?# R6 ~* s1 g) l3 u* M! W三、寡糖链的组成、连接和结构   
      糖类可以分为单糖、双糖、寡糖、多糖及它们的衍生物。单糖是多糖的基本结构单位，目前已经发现有二百余种单糖。构成人类糖蛋白分子的单糖主要有8种:葡萄糖(Glc )、半乳糖(Gal)、甘露糖 (Man)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc), N-乙酰神经氨酸(NeuAc )、岩藻糖(Fuc)和木糖(Xyl) 。(表14一3)   
       按这些单糖构成的寡糖与蛋白质的连接方式糖蛋白可分为三种主要类型(图14一1)：   
, s; A6 C+ _7 B. S       (1)O-连接糖蛋白:其肽链中含有羟基的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr )，和糖(如Ga1NAc)通过O-糖苷键连接。   
. s3 n1 M$ |5 G0 \       (2) N-连接糖蛋白:其肽链中的天冬酰胺(Asn)的酰胺氮和糖通过N-糖苷键连接。
       (3 )GPI连接糖蛋白:是通过肽链羧基末端的氨基酸与糖基磷脂酰肌醇锚的寡糖部分结合。
- v, M0 |) d! q        糖蛋白的生物学作用与寡糖链的结构有关，尤其是其糖链的末端糖基常对功能起决定性作用。目前对 N-连接糖蛋白的研究和了解较多，大多数比较易于得到的糖蛋白包括膜蛋白和血液循环中的蛋白质都是这种类型。通过N-连接和肽链相连的寡糖链称为N-连接寡糖，按其糖基的组成主要分复杂型、杂合型和高甘露糖型三种类型。这三型N-连接寡糖都有一个五糖的核心结构，高甘露糖型在核心五糖上连接了2～9个甘露糖;复杂型在核心五糖上可连接2、3、4或5个分枝糖链，宛如天线状，天线的末端常连有N-乙酰神经氨酸;杂合型则兼有二者的结构。如前所述，N-连接寡糖中的N-乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基连接，还需要一定的条件，即只有在特定的氨基酸序列中，即Asn-X-Ser/Thr(其中的X可以是脯氨酸以外的任何氨基酸)3个氨基酸残基组成的序列子(sequon)才有可能，这一序列子被称为糖基化位点。一个糖蛋白分子中可存在若干个序列子，但它实际能否与寡糖连接还取决与其周围的立体结构。

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      通过O-连接和肽链相连的寡糖链称为O-连接寡糖，常是由N-乙酰半乳糖胺与半乳糖构成核心二糖，核心二糖可重复延长及分支，再连接上岩藻糖、N-乙酰葡糖胺等单糖。其多肽部分的糖基化位点还不清楚，但通常存在于糖蛋白分子表面丝氨酸和苏氨酸比较集中且周围常有脯氨酸的序列中。粘蛋白中含有大量的O-连接寡糖，而且O-连接寡糖常以簇集的形式存在。
: j  D& A! r, f2 [4 s5 D/ {四、寡糖链的合成   
$ f8 l, S8 I4 W6 A. f4 \* R      糖蛋白分子包括多肽与糖两部分，其中多肽部分按一般的蛋白质生物合成在粗面内质网内进行，在此主要介绍其寡糖链部分的合成。各种糖链的合成方式有所不同，以下简要介绍N-连接与O-连接寡糖链的合成。N-连接寡糖是在粗面内质网和高尔基体中合成的，是与蛋白质肽链合成同时进行的共翻译过程。在内质网上以长萜醇作为糖链的载体，在糖基转移酶的作用下，以核苷酸糖(如UDPGlcNAc、CMPSia、GDPMan等)为供体，先将其中的糖基转移到长萜醇，然后再逐个添加上糖基。每一步反应均由特异的糖基转移酶催化完成，直到形成含有14个糖基的长萜醇焦磷酸寡糖结构，此含14个糖基的寡糖(G-寡糖)作为一个整体再被转移到多肽链糖基化位点中天冬酰胺残基的酰胺氮上形成N-糖苷键。寡糖链还依次在内质网和高尔基体中被加工，先后由糖苷酶(糖基的水解酶)水解除去葡萄糖和部分甘露糖，再由糖基转移酶催化加上不同的糖基，最后才生成成熟的各型N-连接寡糖(图14一2)。

     O-连接寡糖的合成与N-连接寡糖不同，O-连接寡糖合成是在多肽链合成后进行的，而且没有糖链载体。在Ga1NAc转移酶的作用下，将UDPGa1NAc中的Ga1NAc基转移到多肽链的丝氨酸(苏氨酸)的羟基上，形成O-连接，然后逐个加上糖基，每一种糖基都有其相应的专一性的糖基转移酶。整个过程在内质网开始，在高尔基体内完成。  
      糖苷键合成的中心步骤是糖基转移酶的作用，它与对应的底物之间有高度特异性，即对供体核苷酸糖与受体之间的定位相当准确。糖基转移酶的催化作用通常是可逆的，但是对IgG则不然。有研究认为糖基转移酶的连续排列能够提高生物合成的效率。通过糖基转移酶的连续作用得到寡糖链和糖基的结构，这种结构反映了糖基转移酶系统的组成。
      在寡糖链的合成中还需要多种糖苷酶(glycosidases)，它们对作用的部位具有特异性，现已证实糖苷酶对糖蛋白结构和功能的检测很有帮助。这些酶作用于寡糖链远端的称为外切糖苷酶，作用于靠近肽链端糖链的称为内切糖苷酶。外切糖苷酶有神经氨酸酶和半乳糖苷酶，它们可以将大多数糖蛋白糖链末端的NeuAc和Gal移走。内切糖苷酶有内切糖苷酶F和内切糖苷酶H，它们可以特异性的切除靠近肽链的GlcNAc 。  
      总的来说，寡糖链的合成需要以下因素的参与:①需要有功能性糖基转移酶在细胞内合适位置的表达。②需要有核苷酸糖的合成并移位至高尔基体内。③对细胞内受体底物进行合适的加工。④没有其他抑制因素如糖基转移酶抑制剂的影响。
  v& \3 X( \6 d( m6 c. U+ b7 b五、生理和病理情况下寡糖链的变化   
( B( ~5 K3 ?3 @) `( ?6 Q      生理条件下，不仅在不同物种的同一种细胞中其糖蛋白大有不同，即糖蛋白具有种属特异性;同一个体的不同组织的糖蛋白也不相同，即有组织特异性;同一种组织不同的细胞、甚至相同的细胞在不同的分化时期或在细胞繁殖周期的不同阶段，糖蛋白的糖链结构也会有所改变，即具有阶段特异性。胚胎发育中就有阶段特异性的寡糖抗原表达。如果糖蛋白的肽链相同，仅其糖链结构有所不同，这称为糖蛋白的不同糖形(Glycoform)。糖形影响糖蛋白的功能。  
      病理条件下，糖蛋白糖链的改变常有重要的病理学意义。炎症时局部血管内皮细胞表面的糖蛋白(或糖脂)末端糖基的变化，可引起炎症细胞的聚集;肿瘤细胞表面糖链的改变可能与肿瘤的转移有关;一些糖蛋白或糖脂的糖链合成异常是遗传病的病因;异体器官移植由于供体细胞的糖链与受体不合而引起严重的免疫排斥。总之，糖链结构变化的病理意义在研究中受到了人们极大的关注。
六、研究糖蛋白的实验室方法   
      与核苷酸和蛋白质不同，糖链很少以线性和无分支的形式表达。正因为这样，糖链可以受到多种形式的修饰，所以用单一的方法难以完成对寡糖的测序，必须组合多种物理和化学方法，才能得到明确的糖链结构。
3 L/ d8 j1 }* j2 S. @" k      从糖蛋白的发现、纯化到结构分析，研究人员经过相当艰辛的过程才逐步建立起糖蛋白的分析方法。纯化蛋白或酶的传统方法对糖蛋白的纯化同样适用，比如盐析法、亲和层析法、离子交换法等。一旦糖蛋白被纯化得到，可以用多种HPLC法测定各种寡糖成分所占的比例，用质谱分析法(mass spectroscopy)、高分辨磁共振光谱分析(high-resolution NMR spectroscopy)识别糖链的结构。在这过程中还可以使用其他的研究工具和方法，比如内、外切糖苷酶，凝集素，化学的修饰和裂解，代谢性放射标记，糖基化抑制剂和激动剂，抗体，糖基化转移酶的分子克隆以及对完整的细胞和有机体进行基因操作等。
七、凝集素在糖蛋白中的作用
- h# v9 G) i2 v7 T6 \' Q4 D, u5 U      凝集素是一种无免疫源性的糖连接蛋白，它可以凝集细胞和沉淀复合糖。凝集素在生物界分布很广，不仅存在于植物的各组成成分中，而且存在于真菌、细菌、病毒、各种动物乃至人体的各种组织和器官中(表14一4)。它主要有以下几个特点:①一个凝集素至少包括两个糖结合位点。如果它只有一个糖结合位点，那么它将无法凝集或沉淀那些含有糖基结构的蛋白，也就不能称其为凝集素。②凝集素的特异性通常是由单糖或寡糖与其之间的相互作用决定的。③凝集素可以出现在多种类型的生物体内，它们以可溶性的形式存在或是被整合到细胞膜中，本身也可以是糖蛋白。④如果具有多个糖结合位点，糖特异性酶、转运蛋白和毒素都有可能成为凝集素。通常凝集素与酶的作用方式不同，它们与作用的物质不发生催化反应，所以至今它们的生理功能还不清楚。不过有一点无人反对，就是凝集素是“糖编码的译码器(decophers)”。    -
      正因为凝集素具有以上的特点，所以它的应用十分广泛，凝集素在糖蛋白中的作用主要有:①用于纯化和分析糖蛋白，如凝集素刀豆素A(ConA)以共价形式联合在层析柱材基质上(比如琼脂糖)，组成ConA-琼脂糖层析柱，通过糖蛋白中的寡糖链与ConA结合，可以得到纯化的糖蛋白。②作为探针检测细胞表面特异性糖链。因为凝集素可以识别特异性糖链，所以一般来说，它们能够作为探针识别暴露于细胞表面的糖基。
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血清中具有抗体活性或与抗体相关的一类球蛋白，通称为免疫球蛋白(immunoglobulin ,Ig)，其中包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五大类。免疫球蛋白都是糖蛋白。Ig最主要的功能是它的抗体作用，它能与抗原(包括外来的和自身的抗原)相结合，从而有效地清除侵入体内的微生物、寄生虫，中和它们所释放的毒素，或清除某些自身衰老的细胞或产物等，是机体免疫系统中重要的组成部分，又是其进行自我调节的重要因素。
一、免疫球蛋白的基本结构
- E6 p" Q8 @) `; x- \) P现已完全肯定，具有四条肽链的Y形结构是Ig的基本结构模式。其中两条为重链(约50kD)，两条为轻链(约25kD)。重链可有五种类型，由此将Ig分为IgG (γ链),IgA(α链)、IgM(μ链),IgD(ó链)和IgE（ε链)。轻链有两种类型: κ型和λ型。同一抗体的两条轻链总是相同的，即均为κ型或均为λ型。同一个体可能同时存在κ型和λ型，但κ型与λ型的比值不同种属可互不相同。如小鼠中95%为κ型，马则95%为λ型，而人类的κ/λ为2/1。表14一5列出血清中各种类型Ig的性质。   
3 B4 ^$ l" d( f      以下用含量最多、研究最透彻的IgG为例来说明Ig的结构。IgG经木瓜蛋白酶水解生成Fab(ab表示可与抗原结合)和Fc (c表示可被结晶)两个片段。对这些片段的分析证明Fab段保持原有的抗原结合特性，而Fc段并无与抗原结合的功能，但含有各种Ig的抗原决定簇。用胃蛋白酶水解IgG，结果只得到一个沉降常数为5S的片段称为F(ab)2，它可保持原有抗体的双价活性。将F(ab) 2缓和还原和烷化，就可断裂分成两个片段，其免疫特性与Fab段相同，即只能与一个抗原分子结合。由此提出IgG的四条链成对存在，相同的两条重链通过二硫键连接呈Y形，两条相同的轻链通过二硫键连接在重链Y形两臂的两侧。IgG的抗原结合部位在Fab段的末端。两个Fab段与Fc段的连接可能快速的变化，电镜观察发现Y形的两臂可伸展成180°，故将连接Fab段与Fc段的区域称为铰链区。对铰链区的氨基酸结构分析结果表明它与Ig其他区域无类似性，具有较多的脯氨酸残基，不形成α-螺旋的构型，以致铰链区比较伸展，易被酶分子靠近而水解。
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     经氨基酸序列分析表明，轻链的214个氨基酸中N端的108个氨基酸的组成差异很大，而109～204氨基酸之间的序列则大致相同，故将前者称为可变区(V区)，后者称为恒定区(C区)。
      随着对各种Ig重、轻链序列的测定资料的增多，就有可能对这些序列进行比较，分析其与抗原结合部位的细微结构。分析结果说明轻链的V区有三个特殊的区域，在其中一个区域的氨基酸序列变异大大超过V区的其他部位，这个区域被称为超变区。超变区以外氨基酸序列的变异是有限的，从而提出抗体 V区中仅仅超变区是形成高度特异性的抗体与抗原结合的部位，而V区其他部位是为超变区提供适宜的三维空间折叠所必需。   
4 Y+ J6 i$ ]9 T3 o      免疫球蛋白(包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)是一类结构类似的蛋白质，它们都具有大约含有100个氨基酸残基的结构域(domain)。从Ig立体结构分析发现，任何结构域多肽的折叠基本相似，只是 V区的比C区的多一个小环。这些肽链处于一系列的折叠中，其走向与功能区的长轴平行，相邻的肽链间相互平行，并形成两个平面，在两层平面中间集中着疏水氨基酸残基，两平面间以双硫键相连。其中一个平面(V区)有三条β折叠，另一平面(C区)则有四条β折叠。而原来分散的三个超变区通过肽链的折叠走向，在立体结构上都聚集到了一起，位于Fab段N端的V区表面，形成了一个凹形的抗体结合部位。整个的Ig分子即由免疫球蛋白折叠(immunoglobulin fold)的基本功能单位组装而成。
二、免疫球蛋白的糖基化   
      1.糖基化的部位和影响因素
7 {* }( N8 }( _9 a7 m7 x; l7 x      分泌型蛋白和位于细胞表面的蛋白受到多种转录后修饰，糖基化就是其中的一种特殊形式。糖基化是通过N-连接、O-连接等方式使寡糖与肽链共价结合。肽链的糖基化有以下几个特点:①同一种细胞中的不同糖蛋白包含不同的寡糖结构;②同一个多肽上可以携带多种不同的寡糖结构;③在同一个糖基化位点可以发现多种寡糖结构(即寡糖的异质性);④同一个糖基化位点上寡糖结构异质性的形式可以再生，而不是随意出现的;⑤细胞的类型对于寡糖的加工很重要。众所周知，糖蛋白的多肽链的合成是受基因控制的，但与蛋白质相连的寡糖链的合成并没有严格的直接的核酸模板指导，而是由酶催化的糖基转移(糖基转移酶)或剪接(糖苷酶)完成的。通常一个单一的多肽链在生物合成中是以不同的糖基化混合物的形式出现，这种具有不同糖基化形式的单一多肽，就称之为蛋白质的糖形。糖蛋白一般均有多种不同糖形存在。
5 H; J% J4 y  f$ O( J) [- q      以下用现已研究得比较深入的N-连接寡糖糖链的生物合成来说明糖蛋白糖链的合成与加工。图12一2说明N-连接寡糖链的合成过程和经过剪切及糖基添加生成不同类型寡糖链的途径。糖蛋白中寡糖链的多样性即具有多种糖形是在高尔基体中的糖基化加工过程中产生的。模式图说明在内质网中磷酸多萜醇寡糖前体的添加是与新生肽链合成同时进行的;然后，在葡萄糖苷酶I和II的序列作用下，切去三个葡萄糖残基;再进一步被甘露糖苷酶作用后，合成中间物转入高尔基体，在此再被加工成为杂合型或复合型。  
      虽然，糖蛋白均在特定的细胞器内质网合成并可由此进人分泌途径，即所有的蛋白质都处于相同的糖基化机构中，但蛋白质所具有的可能的糖化位点并不是同样均可被糖基化的，糖基化的具体部位和程度受到多方面的影响。首先，受蛋白质三维结构的影响，如在蛋白质亚基中不同结构域的相对位置;其次是连接寡糖链结构域的空间结构及其所在局部的三维结构(如形成肽链回转的襻、螺旋结构或形成片层折叠，有无双硫键形成等)的影响;此外，还受到糖基化位点所在部位或其周围的氨基酸序列的影响。即使是同一个蛋白质分子，它的糖基化还受到以下因素的影响:①不同糖基转移酶或糖苷酶间的竞争;②核苷酸糖底物的提供;③新生肽的运转速度等的控制。由于观察到糖蛋白整个的加工过程中通常是以多糖形的混合体存在，提示蛋白质三维结构的调控完成后，其糖基化本身是由细胞操纵和继发的。因此，细胞可以通过改变其分泌的糖蛋白各糖形成分来应答内环境或外环境的变化。目前，糖基化各种影响因素中，糖基转移酶或糖苷酶的表达和调控受到广泛的重视。   
      2.糖基化种类和糖基化位点   
      免疫球蛋白都是糖蛋白，糖基化的不同对其功能有重要的影响。对不同类型Ig的糖基化位点所在的部位已进行了深入的研究，已知在各种免疫球蛋白的Fab段不同的区域仅IgG和IgA有糖基化，在铰链区IgA和IgD有O-糖基化链，而在高度保守的Fc区所有的各类型Ig都有N-糖基化位点。这些N-糖基化位点在IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH2结构域均含有。此外，IgE和IgM在CH1结构域，IgD、IgE和IgM在CH3结构域，IgA和IgM在非免疫球蛋白结构域的尾段还有N-糖基化位点。有趣的是，虽然所有的免疫球蛋白的C区高度保守相似，但在不同种类的免疫球蛋白间，甚至在同一种免疫球蛋白分子的不同结构域，其糖基化位点却并非完全保守。

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一、IgG分子的糖基化位点和糖形   
/ Q7 Y) W) i" P  ]4 [      免疫球蛋白分子是由各自的含有C区和V区的重链与轻链在内质网组装而成，其糖链是添加到完整的蛋白质分子上的。IgG是人类血清中主要的抗体，约占成人血清中免疫球蛋白的75%。血清中的IgG占全身总量的50%,其余部分分布在各种组织中，但其含量可因个体差异和同一个体不同条件(如感染)而变化。   
      IgG同其他的免疫球蛋白一样具有两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H), L链是由两个功能区组成，分别是位于N端的可变区(VL)和C端的恒定区(CL), H链则是由一个位于N端的可变区(VH)和三个位于C端的恒定区(CH1、CH2、CH3 )组成。每条H链包含一个与位于Fc段CH2功能区Asn-297相连接的糖链。免疫球蛋白的这些功能区之间(如VL和VH,CL和CH1，以及两个CH3之间)都有很强的相互作用;但是在两个CH2功能区之间没有相互作用发生。研究认为，主要是在CH2功能区之间插入了糖链的缘故。
      在IgG分子中的Fab和Fc段均有糖基化，平均每个分子可连2.8个N-连接的寡糖，有2个寡糖连接在Fc段。两个重链的CH2结构域各含一个保守的糖基化位点Asn297，在此以共价键与一复合型二天线的寡糖相连;其余的糖基化位点则位于Fab段的高度可变区。通过对兔子IgG Fc段行X线结晶学分析发现，其中一条糖链半乳糖位于Manαl →6Man侧，可以与邻近的CH2功能区上的肽链发生反应，类似凝集素样的关系。另一条Manαl→3Man的糖链缺乏半乳糖残基，它则与对侧糖链的核心部分发生反应，使得两个 CH2结构区联系在一起。
: V9 ]% P  \' z, Z3 ^! ^      人类的IgG分为四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，发现它们主要存在着氨基酸序列的不同，特别是在铰链区和C端结构区。这四种IgG的特性和功能不同。在正常成人血清中，70%的IgG是IgG1，IgG2占20 %，IgG3和IgG4分别占6%和4%。不过这个比例在感染、类风湿关节炎等病理状态下明显不同，因为这些疾病会造成IgG亚类功能的丢失。所有的IgG亚类都含有糖基。   
' _5 W- K3 B2 ?6 U/ r* ~) s: N7 g      IgG连有多种不同的复杂的中性寡糖，其中有的也可能被唾液酸化，现发现总共可能有30种不同的寡糖。正常情况下，人血清IgGV区的Fab段主要含有核心岩藻糖化或唾液酸化的二天线的寡糖，其中含平分型N-乙酰葡糖胺残基的约30%。Fc区含较少的唾液酸化平分型寡糖。利用HPLC(高效液相层析法)，根据二天线结构复合寡糖链末端含有的半乳糖残基数，可将IgG的糖形分为三种类型，分别称为G(0)、G(1)或G(2)型。半乳糖残基既可以位于糖链α1-3臂，也可以位于α1-6臂。G(1)和G(2)型可能被唾液酸化。再按其是否具有核心岩藻糖及平分型N-乙酰葡糖胺残基又分为四组。  
      将HPLC技术与酶解和质谱分析联合应用，鉴定在IgG的Fab和Fc上的寡糖结构，发现不仅在Fab和Fc段的寡糖有部位特异性，而且在Fc段的二天线寡糖链的两个分支αl→3和。α1→6的结构也有所不同。如α1→6臂比αl→3臂末端半乳糖基化高，并且α1-6臂没有唾液酸化。应用NMR弛豫分析 Fc段寡糖，结果表明，寡糖与蛋白质的相互作用主要发生在αl→6臂的半乳糖基和蛋白质表面。末端缺乏半乳糖基的寡糖则不与蛋白质相互作用，该寡糖链有较大的活动性，并使原来寡糖覆盖的多肽表面裸露出来，因此该寡糖链的活动性是由其基本的组成序列决定的。
二、糖基化对IgG分子的影响
) [7 e5 k6 T" |# S$ ]     糖基化对整个IgG分子可能有灵敏而特异的影响。已知IgG分子Fc段的糖基化对其正常生理作用和某些疾病的病理作用都极为重要。目前经计算机模型研究表明，糖基化似乎对IgG分子CH2及结构域的空间结构影响不大，但不能排除对糖基化三原序列子局部构象影响的可能。对于这些具体影响，虽然目前还不能用完整的IgG分子来进行研究，但将具有天然Fc寡糖的人IgG经蛋白酶水解、分离得到Fc糖基化部位的糖肽(Fc段的294～300残基)为样品，经过磁共振分析比较，表明无糖基化的类似物对糖肽在 Asn297糖基化位点周围形成瓶颈状排列的个别氨基酸(Gln295和Thr299)的化学位移存在着显著的差别，说明这部分结构的稳定性降低。经对CH2结构域相关的生物活性分析表明，去糖基化时IgG与Clq的结合下降。此外，IgG突变体的非糖基化的单克隆抗体，失去318、320和322残基参与的和单核细胞结合的能力。此结果说明寡糖可能对保持单核细胞结合能力所必需的绞链区构象的稳定有关;除去寡糖后使CH2结构域的稳定性下降，对胃蛋白酶水解的敏感性可增加60倍。总之，CH2的糖基化和IgG分子的稳定性关系密切;而在Fab段的高度可变区的糖基化则与抗体对抗原的识别有关。   
. {, Q" v+ t* @      利用内切糖苷酶和外切糖苷酶对糖链的作用，以及由杂交瘤细胞得到的非糖基化IgG研究糖链对IgG功能的修饰作用，认为糖基化对IgG有以下一些作用:①减弱Fc段受体的结合力;②降低补体的激活作用;③减弱对抗细胞毒性依赖性抗体的诱导;④降低去除血循环中免疫复合物的能力;⑤减弱免疫抑制性反馈。

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一、类风湿关节炎IgG糖链的变化  

      在许多情况下，糖基化的异常与自身免疫病的疾病过程有关。在某些自身免疫病中，糖基化的改变甚至有着关键的病理学上的重要性。在 60年代早期认为RA是一种含有自身免疫成分的发病率高的慢性全身性疾病。1975年Mullinax首先观察到RA病人血清中IgG的脱半乳糖基(agalatosyl)的成分增加。1985年，Parekh等通过肼解作用从IgG中分离得到寡糖，经Bio-Gel P-4柱层析法洗脱，比较健康人群和类风湿关节炎患者血清中的糖链结构，发现类风湿关节炎患者IgG寡糖链半乳糖化的成分减少，也就是说血清中IgG (0)增加。在1985年，英国剑桥与日本东京两个研究组分别从46个IgG样品中分离得到大约1400个寡糖，细致地分析RA、原发性骨关节炎(OA)和正常人血清IgG的糖形后，其结果明确表明:RA及OA患者与正常人血清中分离的IgG比较，其N-连接的二天线复合型寡糖结构的分布的不同是由于半乳糖基化的程度改变引起的，并没有新型的寡糖链出现;即半乳糖基化的相对程度的下降，造成IgG中含两个N-乙酰氨基葡糖末端的寡糖链[这种寡糖链被称为脱半乳糖基IgG，即IgG(0)]的增加，和含一个或两个半乳糖末端的减少。已经分析证明，IgG(0)的增加主要由于在IgG的Fc段寡糖的变化，并见于4种IgG亚型。正常人与患者血清中IgG (0)含量存在的差别明显，尤其以RA的升高更为显著。正常人血清IgG中IgG(0)仅占24%左右，OA中占35%左右，RA患者血清中则高达50%以上，分析结果从结构上证实了早期观察到的现象。1988年，Parekh等对不同年龄、性别的正常人群的IgG糖链半乳糖基变化的研究，显示人体内IgG(0)的含量与年龄相关:在1～15岁时，体内的IgG(0)的含量很低，并在40岁以前基本保持不变，以后随着年龄的增加，其含量也逐渐增加。1989年，Parekh等对25种不同疾病中IgG (0)的含量进行了一个大规模的研究，证实在RA、肺结核、克罗恩病和合并干燥综合征的系统性红斑狼疮，IgG(0)的含量明显增加。90年代的早期和中期，在天然的或诱导生成的RA的动物模型中也证明了这种IgG糖形的变更以及G(0)与RA的发病有关。

% `; g% `' w9 j* T, O. G二、IgG (0)糖形的特点和性质   

      虽然，G(0)和G(1)、G(2)糖形仅有一个半乳糖基的差别，但经过结晶学结构分析、X射线衍射和NMR分析，均表明IgG的Fc段寡糖末端的半乳糖基对该寡糖链活动的自由度，以及对寡糖与蛋白质的相互作用有明显的影响。如NMR松弛(relaxation)研究指出对具有G(0)型寡糖和G(1)型寡糖的IgG分子比较，具有G(0)寡糖的蛋白质表面溶剂可接近的程度增加;半乳糖基缺失的寡糖和蛋白质的相互作用减弱，导致寡糖在所观察的结晶结构的X射线衍射分析中转位。由此使 G(0)寡糖构象活动的自由度加大，而暴露出其末端GlcNAc基团。由这些分析结果将IgG的糖形区分为两组:G(1)和G(2)糖形是结合的，其活动是相当受限制的;而G(0)糖形独立于蛋白质，具有相当的构象自由。在1,6臂上的末端GlcNAc残基使该糖形可与甘露糖结合蛋白及某些特异的凝集素(如PBL)反应。
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0 W4 U' g( d! p0 }三、IgG寡糖链的鉴定方法及其应用   

  J8 n* ], c0 K: ?3 h      如前述，已知在IgG上Fc段的两个结构域各含一个保守的糖基化位点Asp297，该位点以共价键与一复杂型的二天线的寡糖连接。以前曾通过多种方法来研究此相连糖链的结构特点，如20世纪80年代中期，Parekh等先用肼解从IgG分离寡糖链后，再经外糖苷酶水解并应用Bio-GelP-4柱层析等长时间艰苦的分析过程，对所有与IgG相连的寡糖进行了分析，提出了值得确信的结果。其后，有人将IgG样品经蛋白水解酶作用后，用葡萄糖胺酶A将糖链分离出来，最后用填充氨基吡啶衍生物的正向柱和反向柱进行 HPLC分析。有的人结合肼解作用和HPLC的方法，其中HPLC采用的是氨基吡啶衍生物弱离子交换柱和正向柱。还有的人用不同种类的层析法和凝集素分析法比较鉴定从IgG糖链上释放的寡糖。另外，有报道联合应用酶处理分离寡糖和寡糖经8-氨基萘-1,3,6三磺酸荧光标记后电泳分析(FCE)的方法，分析与IgG连接的各种肽寡糖的结构特点。这些方法的目的是分析IgG样本半乳糖残基在糖链中的比例，上述方法都有各自的特点。
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      在最近，经过对多种类风湿疾病与正常人血清的分析比较后，认为应用FCE这种方法不仅可以测定寡糖链末端糖基的半乳糖基化，而且可比较糖链的唾液酸化和核心岩藻糖化等其他结构特点。尽管风湿病如强直性脊柱炎(AS)、银屑病关节炎(PsA)和 RA患者血清中IgG的寡糖链都表现有去半乳糖基的变化，且相互未见明显不同，但糖链中其他糖基的组成却有明显差别。FCE法可予以区别鉴定，故有可能用于类风湿关节炎的早期诊断和鉴别诊断。  
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# w. W# u8 P0 N5 m- B+ P& N      利用凝集素的糖结合特性(如RCA I对半乳糖和BS II对N-乙酰葡糖胺能识别的特点)，许多研究者建立了快速的免疫印迹技术来分别检测寡糖链末端的半乳糖基或N-乙酰葡糖胺基。基于RCA I的结合特点设计了ELISA方法测定半乳糖基化的IgG方法。此外，还应用抗GlcNAc的单克隆抗体来测定失半乳糖基的IgG等。这类简便的而又较特异的方法用于临床测定已有多方报道。作者的实验室最近建立了改良的凝集素PVL的ELISA方法，试用于RA的辅助诊断得到较满意的结果。   

      另外，质谱分析技术的应用为IgG寡糖链的研究带来了新的前景，它解决了许多对糖蛋白结构识别的问题。随后出现的快速原子碰撞质谱法(fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)以及电子喷射质谱法(electrospray mass spectrometry, ES-MS)，是分析糖蛋白结构特点的有力工具。它们有以下一些作用:①辨别糖基化的类型和糖基化异质性的程度;②确定糖基化的位点;③明确糖链分支结构;④测定糖链分支的数量和长度;⑤鉴别所有与非还原结构无关的序列及它们的大小或异质性的差异;⑥证明N-乙酰乳糖胺糖链的存在;⑦测定重组糖蛋白糖结构的精确度;⑧明确结构的异常是否来自生物合成的缺陷。

四、RA患者IgG(0)增高的机制   

' @5 I4 w5 Z; x% L6 F- Y8 ]7 k      如今人们普遍认为，RA患者的IgG(0)异常增高的原因与一个完整的糖基化体系在正常免疫机制中的作用有关，RA患者该体系的调控出现障碍。对于寡糖链的合成和组成特异的糖基转移酶在引发IgG(0)增高的方面起了关键的作用。目前认为RA患者血清中IgG(0)增加主要与半乳糖基转移酶(GalTase)的活性降低有关。在对糖基化调控机制的研究中，发现淋巴细胞的GalTase活性和正常人、RA患者以及非自身免疫性关节炎患者血清中的去半乳糖基的IgG(0)水平有关。RA患者淋巴细胞的GalTase活性降低，IgG(0)水平增高，而且其IgG(0)水平与GalTase活性呈线性负相关，而在正常对照组则为微弱的正相关。
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      糖蛋白中的UDPβ1,4半乳糖基转移酶是一种细胞内的膜结合酶，主要位于高尔基体内，但也可位于细胞表面，或以一种可溶性的方式存在于乳汁、羊水、脑脊液、唾液、尿液和血清中。GalTase的主要作用是在IgG寡糖链延长过程中，催化半乳糖由UDP-半乳糖转移至N-乙酰氨基葡糖。基因编码的人类GalTase被认为位于9号染色体上，它对多种mRNA转录物具有特异性。Tomana等研究指出，产生抗体的B细胞内GalTase活性的改变可能导致 RA患者IgG糖链上半乳糖基的缺失。  
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      是什么因素造成GalTase活性的下降呢?有研究者对多种自身免疫病的糖基化变更的机制进行了多方面深入的探讨，认为与以下几种机制有关:  

- y( `7 p4 g1 s9 G+ D! d     (1)与半乳糖基转移酶抗体有关:至今还没有发现任何证据表明存在细胞内酶的抑制剂，或者是酶的基因结构的异常改变。目前已经找到与控制机制相关的一种抗体，即半乳糖基转移酶抗体。半乳糖基转移酶抗体存在于多种疾病中。IgG半乳糖基转移酶抗体在RA、克罗恩病、SLE和肺结核中明显增加，但 IgA半乳糖基转移酶抗体只在RA、Crohn病中升高;IgM半乳糖基转移酶抗体则在疾病中明显下降。研究发现，IgG半乳糖基转移酶抗体与RA中淋巴细胞GalTase活性正好相反，即IgG半乳糖基转移酶抗体升高，淋巴细胞GalTase活性下降;反之亦然。所以，有人认为IgM半乳糖基转移酶抗体也许是正常糖基化调控机制的一部分，而IgG半乳糖基转移酶抗体与RA有关，可能引起淋巴细胞GalTase活性的下降。  

+ h3 v0 \# O# \6 y  x$ }9 \     (2)半乳糖基转移酶活性受p58GTA激酶表达的影响:p58GTA是一种编码434个氨基酸的蛋白质。Bruce等进行了p58GTA在体内、外对哺乳动物GalTase活性表达的实验，发现在体内p58GTA的表达能够将GalTase活性提高大约3倍;同时实验结果显示，当GalTase失磷酸化或产生抑制p58GTA活性的特异性抗体时，GalTase活性将随之下降。所以，Bruce等认为 GalTase活性受到磷酸化的影响，而p58GTA可能在其中起到调节的作用。   
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5 w  u( m/ a3 E# G五、IgG (0)在RA发病中的作用   

9 K5 l* f; ?1 ]5 X- ^+ d) S1 P      虽然在RA患者血清中所含的IgG (0)比例增加的现象已勿庸置疑，而且在RA的关节滑膜液中，含有大量的IgG(0)，在局部沉积的抗原-抗体复合物中也包含多量IgG(0)，但在机制复杂的自身免疫病中，IgG(0)在RA发病中的作用仍是有待深入探讨的问题。有的认为IgG的半乳糖基缺失具有重要的原发性病因，有的则认为这仅是有趣的附带现象。虽然已在经II型胶原致敏的小鼠用IgG(0)做尾静脉注射后，证明可引起小鼠的关节炎，说明IgG(0)是重要的致病因子，但至今还未得到它可引起人类RA的确切的证据。

2 h( c) }8 x/ J. J9 y* U6 D      已有许多实验结果说明IgG(0)可能具有的病理作用，如:有证据表明脱半乳糖后的寡糖链末端G1cNAc基易于和甘露糖结合蛋白(MBP)结合，从而提出IgG(0)糖形和MBP多聚体的形成可使补体被激活，引起关节滑膜发生慢性炎症，继而使IgG(0)在感染的关节腔内定位沉积;在体外实验发现MBP和IgG外露的G1cNAc基或Man基的结合与抗体激活补体C5成分的性能相应，此结果支持前面的见解;其后，又有实验证明N-聚糖在IgG分子上的方位影响抗体和Clq的结合能力，即影响其对补体的激活能力。此外，还从Fc受体(FcR)的结合观察到，IgG1(0)和IgG3(0)与中性粒细胞上一种FcR的结合比半乳糖基化完全的IgG明显下降，由清除实验表明，这可能与体内对脱半乳糖基IgG的清除率降低有关，由此可能也使得IgG(0)在血清中浓度增加。   

      近年来，糖在免疫学中的作用受到高度重视，有关糖蛋白糖形的不同以及其在蛋白质分子中三维空间的排列的确立，使研究者对疾病和健康条件下的免疫过程有了更深入的认识，同时也提供了一种机制说明通过寡糖的细微结构鉴别非自我与自我的方式。以下通过经典与旁路的补体活化途径来说明IgG (0)糖形可能的作用点和作用机制。简言之，补体可以通过经典途径或旁路途径任一途径活化。经典途径由含IgG和IgM抗原-抗体复合物触发始动，而旁路途径是由病毒、霉菌和细菌等外来小体的表面所始动，两条途径被激活后均导致双分子复合物C3转化酶的产生。C3转化酶将C3分解为C3b和C3a, Cab再与颗粒或细胞共价结合，对其发挥调理作用，使其被具有C3b受体的巨嗜细胞清除。经典和旁路补体激活途径最终结果是在细胞、活细菌或其他病原体表面形成膜攻击复合物(MAC)，由此导致细胞溶解。此外，末端为GlcNAc的IgG(0)在RA患者的血清及关节滑液的含量也见增加。在体外聚合的IgG(0)可与MBP多价结合而激活经典补体途径。在体内，大约80%以上的IgG-RF复合物(它的抗原为其他的IgG分子)由IgG(0)组成，提示沉积的 IgG-RF可能也结合MBP，这提供了一条通路即通过抗原-抗体复合物或通过类风湿因子(RF)复合物可使经典途径过度活化而使炎症发展。宿主细胞通常是通过抑制因子DAF(蜕变加速因子)和CD59(分化抗原簇59)的作用来保护细胞。如CD59位于靠近细胞的表面，与攻膜复合体的C5-8组分结合，防止 C9聚合和完全组装形成MAC复合物;DAF使经典或旁路途径的C3/C5转化酶解离而抑制其组装，从而保护细胞免受补体介导的损伤。这种补体途径的抑制通常受到精细的调节。但补体途径在无病原体的条件下受到过度刺激，如在RA患者，可使抑制系统饱和，由此也导致过度的细胞溶解和炎症。

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自从20世纪60年代中，kunkel HG和TanEM报道RA具有自身免疫成分，可能是自身免疫病以来，研究人员对其体液和细胞的发病机制进行了多方面的研究。20世纪80年代已证实RA的免疫复合物中存在免疫球蛋白，其中的抗体为RF因子，抗原最常见的是IgG。自身抗原免疫活性位于IgG的恒定区CH2，其免疫决定簇不是多肽，而是在糖链。Parekh RB等报道了英国剑桥大学、伯明翰大学和日本东京大学有关研究组从 46份 RA与原发性骨关节炎的IgG样品中分离了400个寡糖链，经过了复杂的硫酸铵沉淀、层析和同位素放射扫描等并结合糖的肼解、还原和酶处理等的分析结果后，明确指出这两种关节炎在N-连接的二天线复合型寡糖结构的分布与正常人不同，但并没有出现新型的寡糖，而是携带有N-乙酰氨基葡糖末端的寡糖增加，因此他们提出这两种关节炎可能是在细胞内糖基化过程或N-寡糖在分泌后降解引起的糖基化疾病。这引起临床工作者的很大兴趣，并根据寡糖链的末端糖基的特点，建立了一些较方便的应用特异的凝集素结合的检测方法，对 RA及其他风湿病和在不同临床情况下血清IgG的糖形进行了观察，其结果表明:  
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     1. RA的早期诊断   
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      早期关节滑膜炎是多种炎性关节炎共同具有的病理变化，这给RA的早期诊断带来困难，以致延误治疗时机。早在90年代初期，Young等经过对60例滑膜炎患者两年的追踪，观察到其中IgG(0)浓度增高的39例发展成RA，而且IgG(0)在血清中含量增高可先于RA的临床症状出现，其余21例IgG(0)浓度正常的患者诊断为其他炎性关节病包括轻微感染及狼疮(P<0.0001)。至今虽RF仍为RA诊断最常用的指标，然而RF对RA的早期诊断不够灵敏，特异性也有不足，如在某些系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征等患者也见RF异常;此外，RF在RA早期其阳性预测率不足80%，但如同时测定IgG(0 )也见其浓度增高，二者结合则预测率可达94%。
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      2. RA疾病活动度的判断  
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     早在80年代末，Parekh等观察了53例病情轻、中、重不同的三组病人，发现IgG(0)的浓度随病情加重而不断增高。RA缓解则IgG(0 )值降至与正常人相同。尤其在妊娠妇女的RA病情观察中，更得到令人印象深刻的结果，患RA妇女大约75%在妊娠期间其病情缓解，且可持续缓解直至胎儿出生。病缓解期间均见IgG(0)浓度下降到正常，而病情复发时其浓度又迅速增高。

0 L! m9 y7 t4 i& S+ ?0 F       3.对RA病情发展的预测   
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       RA病情发展的预后有三种可能，即首次发作后缓解;首次发作后病情持续加重或病情反复发作。为研究IgG(0)浓度对判断首次就诊的患者预后的意义，Bodrnan-Smith等用DFA(差异功能分析)对两组RA患者进行调查，结果表明与 RF、红细胞沉降率(ESR)及握力比较，IgG(0 )水平是最有力的预测指标。IgG(0)水平与首次发作时的握力、年龄及患者的性别相结合，两组的预测力分别达到95%和78%。故认为对首次就诊患者的IgG(0)浓度的测定，对RA预后的了解可能有重要的临床意义。   

. q  H$ q9 f) e' _- c- z/ S. J      目前尚未将IgG(0)作为临床判断RA的条件之一，原因是检测IgG(0)的方法很多，很不统一，各有各的优点。作为一种好的检测方法应该具备以下特点:①能够广泛地在实践中应用，操作较为方便;②能够准确判定IgG糖链中G(0)成分的范围;③能够建立一系列临床试验的标准。Axford等提出使用不同种类的层析法和凝集素分析法比较鉴定从IgG糖链上释放的寡糖，通过HPLC得到IgG(0)所占的比值。相信随着技术日新月异的发展，今后一定能够找到更简便、更科学的测定方法。

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一、RA糖基化异常的特异性  

      在自身免疫病的研究中，随着检测水平的提高，人们越来越认识到糖基化异常在RA发病中的重要性。实验证明，在小鼠的胶原性关节炎中，缺乏半乳糖基的自身抗体比正常糖基化的抗体更容易产生致病性。失半乳糖化的IgG对于某些早期滑膜炎的患者来说，预示着有可能发展成为RA。   
& T0 a. {8 A3 t& C9 O8 x+ o
; s5 j6 ^4 E5 G2 L1 _6 p      研究表明，淋巴细胞中GTase活性的下降与IgG半乳糖化程度的减低直接相关，而且有报道B细胞内GTase酶动力学有异常表现。RA患者GTase对As-Ag-IgG(指的是脱唾液酸、脱半乳糖基的IgG)有着正常亲和性，而对UDP-半乳糖的亲和性则很低。这些糖基化的异常与免疫复合物的增加、补体的激活有关，因此它们有重要的病理意义。将寡糖连接到糖蛋白上不仅与相关酶的作用有关，而且受位于糖基化位点的蛋白质的三维结构的影响，所以说，如果蛋白质的结构发生变化，有可能会诱发糖基化的改变。遗传因素对糖基化也有着一定的影响，在RA中IgG表达的上调与GTase基因表达的下调或酶活性的下降有关，这些都归因于基因突变的产生。   

( T; F, J/ s& H( u  y6 {& X( q      RA糖基化异常的特异性不仅为进一步研究RA的发病原因找到新的思路，而且对于疾病的诊断和治疗也提供了新的手段。

( B0 M5 c& _& ?, j6 `二、RA糖基化与细胞因子   
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( u3 c' O- \8 [# p' [      细胞因子是在细胞之间起信号作用的小分子，有诱导细胞生长、分化、趋化、激活、提高毒性和/或调解免疫功能的作用，它们在RA发病机制中起着重要的作用。目前对RA中两种细胞因子与糖基化的关系进行了研究。

3 R- X2 u/ X8 p  X( k! R      (I) TNF-α与糖基化:TNF-α是RA发病机制中重要的前炎性细胞因子，参与RA的发生发展过程。有试验证明，RA患者IgG糖基化异常可诱导TNF-α的产生，从而促进骨质的破坏和骨吸收，抑制骨胶原的合成，加重关节组织的损伤。
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      (2) IL-6与糖基化:IL-6也是关节炎症中的重要介质。实验证明，它在调控IgG(0)中有一定的作用:①过度表达人类 IL-6基因的转基因小鼠体内IgG(0)的水平很高。②将重组IL-6基因直接注摄入DBA/1小鼠体内，可以导致IgG(0)的水平增高。③IL-6可以引起B细胞内糖基转移酶包括半乳糖基转移酶的活性下降。   

       IL-6引起IgG(0)升高的机制尚不清楚，但是有确切的证据表明:①小鼠腹腔内注射矿物油后，腹腔内IL-6的水平与IgG(0)百分比相关;②在 Castleman病和分泌 IL-6的肿瘤中，IL-6和IgG(0)同时升高;③在RA患者的关节中，IL-6是显著升高的细胞因子之一，来自这些关节的细胞在体外可以自发性分泌IL-6。由此可以看出，IL-6和IgG(0)有着密切的关系。  

& @1 {' t* v, P* H- E三、RA半乳糖缺乏与RF的关系   
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, x+ H0 ?( D7 k: o      RF(类风湿因子)是RA重要的自身抗体。用ELISA法可以在RA患者血清中找到RF的多种免疫球蛋白类型，如 IgG-RF、IgM-RF、IgA-RF等。通常用滴度来表示RFs的高低。RF虽然在其他多种疾病中存在，但是它在RA中的意义最为重要。Ayano等通过分别对10位RA患者和健康受试者其IgG-RF与非IgG-RF和糖基化之间关系的研究发现，具有高滴度的IgG-RF半乳糖基化的水平很低，也就是IgG-RF分子半乳糖基化的减弱可能与RF滴度增高有关。Axford等研究16例IgG中有不同程度半乳糖缺乏的RA和JCA(幼年慢性关节炎)患者，观察其IgG糖链中所含半乳糖基的比例是否影响与 RF的结合，结果显示，RF的功能亲和性与结合脱半乳糖IgG的依赖性密切相关。对Fc和Fab段的研究表明，RA患者位于Fab段的寡糖主要以G(2)的形式存在，而在Fc段的寡糖则以G(0)或G(1)为主，这与上述的研究相符，即当IgG脱半乳糖化时，某些RF与Fc段结合得更牢固。RA患者IgG Fc段寡糖链末端缺少半乳糖基，可以使其抗原性发生改变，这可能通过以下三种机制完成:①脱半乳糖的糖链提供了与其他带有糖链分子结合的空间，比如与IgG上的Fab段结合，IgG Fab段的寡糖有可能插入IgG Fc段的脱半乳糖基的寡糖链中。②脱半乳糖基的糖链将隐藏的序列暴露出来，使之与 RF结合。③缺少半乳糖基的糖链引起Fc段在结构上的改变。另外，X线结晶学显示，IgM-RF与脱半乳糖基的Fc段结合的机制是独特的，与其他抗体结合的机制不同。有关这方面的研究待进一步深入。通过对脱半乳糖基的IgG与RF之间关系的探讨，可以对RF在RA中的作用有更深刻的理解。
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四、糖指纹谱与风湿性疾病鉴别

" r' N( b* X( |: w- U      在正常免疫机制中寡糖有着重要的作用。近年来，随着研究的深入，它们与自身免疫性疾病的关系越来越受到重视。越来越多的资料显示，糖基化的改变与发病机制有关，糖基化作为一个整体系统出现在正常的免疫反应中，然而在疾病中它则表现为调控失常。糖基化不仅只限于半乳糖的变化，还涉及岩藻糖、GlcNAc和唾液酸在糖链中所占比例的变化，这些提示类风湿关节炎与引发IgG正常糖基化改变的特殊机制有关。糖基化的改变除了影响 RA，也可以发生在其他风湿性疾病中，Axford等对RA、JCA、干燥综合征、SLE、强直性脊柱炎(AS)、银屑病关节炎和正常人IgG的糖链结构进行研究，结果显示，只有RA和JCA以IgG(0 )为主，而SLE和AS则以含双半乳糖结构为主。资料表明，每种疾病与一种特殊的机制相关，这种机制能够引起 IgG正常糖基化形式发生改变。IgG的糖指纹谱有利于对风湿病的鉴别，同时可以进一步深入理解疾病的本质。(图14一4)
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对有关免疫球蛋白的糖基化异常和类风湿关节炎的关系，包括其糖链结构、分子构象、基因表达等基础研究，发病机制，临床发病和病情的相关性，以及其糖链特点可能在临床诊断中的应用等，已经进行了持续多年的研究。大量很有说服力的资料说明，IgG糖链结构与RA密切相关。但因类风湿关节炎的病因复杂，还缺乏确切反映人体RA的动物模型，其发病机制仍需进一步深入研究。近年，还观察到某些RA免疫球蛋白的糖链核心部位的岩藻糖化明显增加，但其临床意义还待阐明。最近，将K/BxN转基因小鼠的动物模型和人类的RA联系，通过对其关节滑膜的组织化学分析，观察到RA滑膜表面衬里细胞有高浓度的GPI(糖基化磷脂酰肌醇)沉积，说明GPI抗体可能参与关节的疾病。研究者认为这种动物模型中的现象也可能见于人类 RA，并对发展新型的关节介入治疗提供了思路。此外，有关RA的免疫学研究也十分活跃，尤其观察到CD4+T细胞与RA的炎症的发生和发展密切相关后，细胞免疫在RA中的病理作用目前受到很大关注，免疫球蛋白分子的糖基化改变与细胞免疫是否有关可能也应予以进一步探讨。      
                                                                                                                                                                                                                                          （ 朱正美 ）
. O. ]6 c' ^7 P" K      参考文献：
: Q8 s* d+ G* s+ m# A9 p* A
- j2 X. k0 w' m5 T* p       燕秋，朱正美.免疫球蛋白的糖链与自身免疫疾病.生命的化学，1999. 19 (3) :118一120

      张彦，范成明，朱正美.类风湿关节炎与免疫球蛋白糖基化.中华风湿病杂志，2001.5 (4):243一245   

      张文利，燕秋，朱正美.免疫秋蛋白糖链结构异常和自身免疫性疾病.生物化学与生物物理进展，2001. 28 (3):348-352   

      张彦，范成明，张晓萍，等.类风湿关节炎IgG糖链结构的变化在临床诊断中的价值.中华风湿病杂志，2002. 6(4):286一288  

% P4 p$ R- w0 t1 }: S8 r      Alavi A, Arden N, Spector TD et al. Immunoglobulin G Glycosylation and Clinical Outcome in Rheumatoid Arthritis During Pregnancy. J Rheumatology, 2000. 27(6):1380  
1 t$ E$ H3 Q* M+ C" G6 u  E
      Axford JS. Glycosylation and rheumatic disease. Biochim Et
* w3 f$ U5 h* r* E0 E
, f) I0 q' k- R8 D& c% q9 ^/ J: c      Axford JS. The impact of glycobiology on medicine. Research Update, 2001.22(5) :237一239   
1 L0 ~9 {: j! z9 D" g8 i7 x
      Ayano Matsumoto, Kohdoh Shikata, Fujio Takeuchi, et al Autoantibody activity of IgG rheumatoid factor increases with decreasing levels of galactosylation and sialylation. J Biochem.，2000. 128:621一628  

      Bond A, Alavi A, Axford J S, et al. The relationship between exposed galactose and N-acetylglucosamine residues on IgG in rheumatoid arthritis (RA).juvenile chronic arthritis (JCA) and Sjogren's syndrome (SS). Clin Exp Immun.，1996. 105:99一103   

      BodmarrSmith M D, Anand A, Durand V, et al. Decreased expression of Fc gammaRIII (CD16) by gammadelta T cells in patients with rheumatoid arthritis. Immunology, 2000.99 (4):498一503
' G& k" L+ J5 @" o3 ~
3 ~; e+ I( a* b      Delves P J. The role of glycosylation in autoimmune diseases. Autoimmunity, 1998. 27: 239一253   
8 l& A7 O( q, `& D3 \
Dwek R A, Leouch A C, Wormald M R. Glycobiology: The function of sugar in the IgG molecule. J Anat.，1995. 187:279一292  
3 i: ]% n3 S" D, i8 b. T
      Kiyoshi F, Akira Kobata. Molecular immunology IgG galactosylation-its biological signficance and pathology. Molecular Immunology, 1991.28(12):1333一1340

; E# e# f1 G# z4 t# a      Kobata A. Function and pathology of the sugar chains of human immunoglobulin G. Glycobiology, 1990. 1(1):5一8   

9 G6 p5 I& |) n" X( |) |/ z/ E      Lee D M and W einblatt M E. Rheumatoid arthritis. Lancet, 2001.358: 903一911   

- m1 }+ t4 D# R! |9 ]. ^      Lang A K, Macht L M, Kirwan J R, et al. Ability of T cells from patients with rheumatoid arthritis to respond to immunoglobulin G. Immunology, 1999. 98:116一122  

      Martin K, Talukder R, Hay F C, et al. Characterization of changes in IgG associated oligosaccharide profiles in rheumatoid arthritis, Psoriatic arthritis, and ankylosing spondylitis using fluorophore linked carbohydrate electrophoresis. J  Rheumat.， 2001.28(7):1531一1536

      Miller-Blair D J, Tsuchiya N, Yamaguchi A, et al. Immunologic mechanisms in common rheumatologic diseases. ClinOrthop.，1996. 326:43一54   

1 C. h# U) ]+ n6 d- d       Parekh R B, Dwek R A, Sutton B J, et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature, 1985. 316(6027):452一457  
( }, I+ y0 w% X3 |
       Parekh R B, Dwek R A, Rademacher T W. Rheumatoid arthritis as a glycosylation disorder. British J Rheumatology.，1988. 27(supp1II) :162一169      
- l0 G6 x; \6 y) R
% I7 j/ q/ |2 A1 N0 y8 _$ W       Rudd P M and Dwek R A. Glycosylation: Hetrogeneity and the 3d structure of proteins Critical. Review in Biochemistry and Molecular Biology, 1997. 32(l):1一100

       Rudd P M, Elliot T, Cresswell P, et al. Glycosylation and the Immune System. Science, 2001.291: 2370一2376   

       Rudd P M, Wormald M R and  Dwek R A. Glycosylation and the Immune System. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1999. 11(57):1一21   
  X0 d# _8 Z9 x5 u4 Y9 ^) P
       Wormald M R, Rudd P M, Harvey D J, et al. Variation in oligosaccharide--protein interactions in immunoglobulin G determination the site-specific glycosylation profiles and modulate the dynamic motion of the Fc oligasaccharides. Biochemistry, 1997.36:1370一138。
+ x1 Z- q  o6 b
+ D& d7 E8 E% Z0 V       Watson M, Rudd P M, Bland M, et al. Sugar printing rheumatic diseases. Arthritis and Rheumatism, 1999. 42 (8):1682一1690