8-第8章 细胞凋亡与风湿病的发生机制

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目录：

& J# h; z- L8 q! t+ s% y第一节 细胞凋亡的概念及其与细胞坏死的区别

第二节 细胞凋亡研究进展
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! i1 @( }) P) T* F5 K! ^) z1 n第三节 细胞凋亡与自身免疫疾病

) z9 }8 S4 y: i9 u$ Z第四节 细胞凋亡与风湿病

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细胞凋亡是细胞程序化死亡(programmed cell death)的一种，是指细胞在凋亡因子刺激下发生的受基因调控的细胞自杀性行为。细胞凋亡存在于正常生理情况下，是在个体发育、多细胞生物体平衡和疾病发生中起重要作用的一种细胞死亡形式。早在1842年，有人就观察到正常动物发育过程中的细胞死亡现象。后来，人们又用细胞致密化(pyknosis)、染色质着边(chromatin margination)等术语来描述细胞死亡过程中的形态变化。直到1972年，Andrew Wyllie和 Currie Kerr正式提出了细胞凋亡(apoptosis)这一概念，用来描述以细胞皱缩(shrinkage)、核浓缩(nuclear condensation)、细胞膜发泡(cell membrane blebbing)等为特征的细胞死亡。这些发现揭开了现代细胞凋亡研究的新篇章。   

      细胞凋亡有别于细胞死亡的另一种方式——细胞坏死(Necrosis)。细胞坏死与细胞凋亡的区别首先在于外观形态上变化不同。坏死细胞表现为胀大，细胞膜失去了完整性，易被染料如台盼蓝所透过。而凋亡的细胞则表现为细胞体积变小。更为重要的区别是，细胞凋亡是一个受基因严密调控的生物过程，而细胞坏死则通常是由于偶然因素如受热和药物损伤等引起溶酶体的颗粒内容物释放失控引起的;坏死细胞会引发炎症初期的免疫反应，而凋亡细胞在通常情况下并不诱导抗炎症反应。然而，细胞坏死和细胞凋亡的区别也不是绝对的，同一种诱导因素(如局部缺血、H2O2)可能引发凋亡或坏死，取决于诱导因素的强弱和损伤的严重性。

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一、凋亡相关基因的克隆   
, Y. E7 ]$ J' w$ r( e- c1 {        细胞凋亡研究的快速发展得益于凋亡相关基因的发现。1986年，Tsujimoto教授在美国工作期间，首次克隆了与B型淋巴瘤相关的基因Bcl-2。后来有人证明Bcl-2基因在细胞凋亡调节中起关键作用。大量的细胞凋亡基因的克隆及其相互关系的研究是从实验动物线虫(Caenorhabditis elegans)中开始的。线虫成熟个体总共有 1090个细胞，在其发育过程中，其中有131个细胞会发生凋亡。这些细胞的死亡是受基因严密调控的。有人分离了一些线虫突变体，这些突变体在发育过程中其本应凋亡的细胞不发生凋亡，从而导致了发育异常。袁钧英教授在哈佛医学院Horvitz教授实验室首先从线虫中克隆了凋亡相关基因，并发现Ced-3是caspase的一种类似物，Ced-4是一种新的凋亡调节蛋白。有意义的是，科学家发现Ced-9不仅是线虫凋亡抑制因子，同时也是哺乳动物细胞Bcl-2的同源类似物。这表明了细胞凋亡机制在进化过程中的保守性。线虫细胞凋亡的研究确立了细胞凋亡的基本框架。目前知道，线虫中的Ced-3(哺乳动物细胞caspase类似物)和Ced-4(哺乳动物细胞中APAF-1类似物)为凋亡促进因子。其他的多数基因如Ced-1, Ced-2 ,Ced-5 ,Ced-6 ,Ced-7和Ced-10则负责死亡细胞碎片的吞噬和清除。具体地讲，Ced-6编码一种称为ABC(ATP-binding cassette)的转运蛋白，参与细胞质膜物质转运。Ced-7参与吞噬细胞与凋亡细胞的相互作用过程中的相互识别。Ced-2,Ced-5和Ced-10可能与细胞迁移有关。Ced-5编码一种DOCK180 (downstream of CRK，一种原癌蛋白)蛋白，负责吞噬细胞表面的牵张，以包裹和吞噬凋亡细胞。不同吞噬相关基因如何协调起来参与吞噬过程的分子机制目前尚不清楚。   
      Ced系列基因相互作用，调节细胞凋亡过程。细胞凋亡的经典途径和凋亡基因相互作用的模式图如下(图8一1)：
  

; u: I7 C: h, d4 w% z% u# A      可以说，线虫发育过程中细胞凋亡的研究为哺乳动物和人类细胞凋亡的研究奠定了基础。此后，科学家克隆了大量其他动物细胞凋亡相关基因，即线虫凋亡相关基因的类似物。当然，高等动物细胞凋亡调节机制更为复杂。   
      天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)是Ced-3在哺乳动物细胞中的同源类似物。这一组蛋白酶结构相关，主要存在于细胞胞质中。目前已克隆出16个同源基因，它们的共同特征之一是在细胞内以酶原的形式存在，约30～50kD，这些酶原由一个大亚基和小亚基结构域组成。在caspase激活酶链中，上游的Caspase 8, 9, 10与调控蛋白如FADD和/或Apaf等相互作用，形成复合体。很可能这些复合物的形成促使caspase自动催化裂解，在天冬氨酸残基后的肽键特异切断，形成活性分子。被激活的上游caspase能进一步激活下游的效应分子(effector enzymes)如Caspase 3、6、7等。并不是所有的caspase都参与细胞凋亡，如Caspase 4, 5, 11, 12, 13，很可能参与炎症反应。caspase被激活后能特异切割细胞内多种底物，这些特异性底物包括:①信号分子如MEKK1、p21活化的激酶2、焦点粘附激酶、Raf-1和Akt等。②细胞凋亡调控蛋白如Bcl-2、 Apaf-1和DNA酶(DFF, DNA片段化因子)抑制剂(ICAD)等。ICAD的切割导致有活性的DFF释放并转移至细胞核，切割DNA，形成核小体，这是凋亡细胞特有的DNA阶梯(DNA Ladder)片段形成的主要原因。③细胞周期调控蛋白如Rb(视网膜母细胞瘤蛋白，Retinoblastoma protein)、 Cyclin E等都能被切割。④结构分子如actin、 fodrin、gelsolin、lamin和细胞内重要的酶如DNA修复相关酶 PARP[多(ADP核酸糖)多聚酶，Poly (ADP-ribose) polymerase]等。   
      在凋亡过程中被caspase切割的模式图如图8一2 。Caspase-3酶原为32 kD分子，在凋亡过程中能被Caspase-9或自身切割成分子量为17kD和 12kD的小分子短肽。这两个短肽通过二硫键连在一起，具有蛋白酶活性，能切割多种在细胞中起重要作用的蛋白分子(见正文), PARP是一种 DNA结合蛋白，在DNA损伤修复中起关键作用。它能被Caspase-3切割，丧失DNA修复功能。
         

( j/ d6 u& N  Y( Z# L二、Bcl-2家族蛋白和细胞内的凋亡抑制分子   
& u* q) o2 X7 p$ |& y7 j      Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中起检测点(check-point)作用。线虫Egl -1和Ced-9基  因是Bcl-2及其家族蛋白在人类和其他哺乳动物细胞中的同源类似物。目前已克隆出了24个Bcl-2家族蛋白基因(图8一3)。这个家族中包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包括Bcl-2及同源蛋白Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Al和病毒编码蛋白BHRF1、LMW5-HL、ORF-16、KS-Bcl-2、ElB-19k等，它们多数具有 BHl、BH2、BH3和BH4结构域，其中BH4是抑制凋亡蛋白分子特有的结构域。促凋亡蛋白包括两个亚家族，即Bax亚家族蛋白如Bax、Bak、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNTP3等，含有BHl、BH2、BH3结构域和Bid亚家族如Bim、Bad、Bid、Egl-1等，仅含有BH3结构域。可见，BH3结构域为该家族所共有，并在促凋亡作用中起关键作用。最新的研究表明，人工合成的BH3短肽能诱导线粒体发生凋亡反应。
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( _  A2 t: N! H     有关Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡的机制目前尚不清楚。有很多研究表明，促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白分子相互作用，从而调控线粒体凋亡相关物质如细胞色素C的释放和线粒体的功能。在凋亡因子刺激下，促凋亡蛋白分子以多种方式被激活，并转移到线粒体上，促进线粒体内外膜之间的凋亡相关物质(如细胞色素C)的释放。如Bid能被caspase-8切割，Bid被切割后的产物——tBid能转移到线粒体，与线粒体Bcl-2家族蛋白如 Bax/Bak相互作用，从而诱导细胞凋亡。再比如线粒体Bad能被磷酸化，并与Bcl-XL结合，从而可解除Bcl-XL抑制细胞凋亡的功能。Bax的表达受 p53转录调节，当DNA损伤诱导p53水平升高时能促使Bax蛋白的大量表达。   
       细胞内凋亡抑制因子(intracellular inhibitor of apoptosis, IAPs)是一类独立的抗凋亡蛋白家族，在进化上高度保守。神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)是通过由严重脊柱肌肉萎缩的病人NAIP突变而发现的。这一家族中的另外四个成员分别是c-IAP-1, c-IAP-2 , x-IAP和survivin研究表明，IAPs主要通过抑制效应caspase活性来阻断细胞凋亡。
三、细胞凋亡的信号转导   
       细胞凋亡的信号转导途径(图8—4)可分为受体介导和和非受体介导的凋亡途径两种:   
+ t. {$ P9 L% ]8 m      1.受体介导的细胞凋亡  
) ~. ]( p" k2 m- \; A" Q  d( A       肿瘤坏死因子配体(TNF)及其受体(TNFR)超家族的成员在免疫调节中起着关键作用，有些成员在神经系统或其他器官发育中也起着重要作用。目前已克隆的TNF配体有18个，包括TNF、FasL、TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)等。这些配体多为跨膜蛋白，其胞外区能被金属蛋白酶( metalloproteinase)切割，变成可溶性蛋白汾子。这些分子可形成三聚体或病毒样多聚体来发挥其生物学功效。FasL是一种分子量为40kD的二型跨膜蛋白，即N末端在胞浆，而有150氨基酸的C末端暴露在胞外。FasL与TNF超家族配基有20%～25%的氨基酸相同。FasL主要在眼睛前房室和睾丸中表达，并在CD8+Thl细胞、CD4+T细胞和一些NK细胞中被激活表达。它在细胞表面的存在时间很短，金属蛋白酶可将其细胞外面部分裂解，成为可溶的有功能分子。
   
1 [; P; n8 ^3 s/ j
6 N1 {, J" U9 c4 f3 n& t- F      TNF受体有27个，包括 Fas、TNFR I、DR-3 (TRAMP/wsl/APO-3)、DR-4、DR-5和DR-6。DR-4和DR-5是TRAIL的受体。这些受体包括胞外区、跨膜区和胞内区。在细胞外区域，TNFR家族成员有2～6个富含半胱氨酸的结构域。Fas/FasL的共晶体结构解析表明CRDs以线性排列方式伸出细胞表面，与配体亚基界面有明显接触，每个配体趋向于形成三聚体，配体的聚合促进了受体成簇，受体成簇导致了细胞内结构域的并置和外源信号传人细胞内。TNFR及其家族受体的胞内结构域中有一个约 70个氨基酸的同源区称为死亡结构域(death domains)。最初，形成三聚体的 TNFR和Fas等能通过其凋亡结构域与下游信号转导分子FADD (fas associating protein with deathdomain)相结合。FADD分子是C末端含死亡结构域的蛋白分子，它能通过其N端的死亡效应结构域(death effector domain)进一步选择性吸引Caspase-8和Caspase-10。Caspase-8和10具有双边结构，包括DED和caspase酶结构域，后者把 Fas凝聚和凋亡执行阶段联系起来。Caspase-8和10的前体和激活的Fas复合体结合导致了自我催化裂解和激活，这些酶的激活能够进而启动一个导致细胞程序化死亡的蛋白酶水解体系。TNFR家族成员蛋白还能通过与TRAF(TNF receptor-associated factor)结合激活NF-KappaB和JUN kinase信号途径。   
' }  v4 N- Q( H) l) |       2.非受体介导的细胞凋亡信号转导   
       细胞保持生理活性需要各种生存信号(surviving signals)。相邻细胞间信号和细胞外基质的丧失和变化，支持细胞生长的细胞因子等生长因子不足，多种病毒和多种临床化疗药物和放疗都能诱导细胞凋亡。多种化疗和放疗剂可直接引起细胞核DNA损伤，导致p53含量上升，p53水平的增加诱导促凋亡蛋白分子Bax增加和移位至线粒体外膜。这种移位的Bax能与线粒体上Bcl-2分子作用，促进线粒体细胞色素C释放和细胞凋亡的发生。p53还能诱导细胞周期依赖激活的抑制物P21产生，引起细胞周期停滞。如果 DNA损伤被修复，细胞周期停滞就能被解除，如果损伤不能被修复，则细胞开始凋亡。  
      线粒体在非受体介导的细胞凋亡中起着关键作用。目前知道，线粒体在细胞内不仅作为能量代谢(三羧酸循环和氧化磷酸化)的主要场所，还是细胞凋亡的调控中心。线粒体主要从以下三个相互关联的方面影响细胞凋亡：即电子传递和能量代谢的破坏、凋亡相关物质的释放和细胞内自由基产生的大量增加。这三个方面可能互为因果，即能量代谢的破坏可导致凋亡物质的释放，释放的凋亡物质如细胞色素 C可进一步导致呼吸链和能量代谢的破坏。在正常的生理条件下，细胞色素C在呼吸链上起电子传递的作用，一旦细胞色素C从线粒体释放至细胞浆中，不仅会引起线粒体呼吸链的破坏，导致ATP合成的大量下降，还会引起自由基产生的大量增加。细胞色素 C从线粒体内外膜间隙释放至胞浆中并激活细胞凋亡通路是细胞凋亡研究的一个里程碑式的发现。释放至胞质溶胶中的细胞色素C能与辅助因子Apaf-1结合(Ced-4类似物)并在ATP或dATP存在下促使其形成多聚体，这一多聚体进一步促使Caspase-9与其聚集，形成凋亡小体。这种凋亡小体促使Caspase-9前体转化为其活性形式并作用于效应caspase如Caspase-3，细胞便发生不可逆凋亡。最近的研究还表明，caspase被激活后能反过来作用于线粒体，正反馈调节细胞色素C的释放和自由基的大量产生。此外，在凋亡因子的刺激下，线粒体还释放细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)和Nuclease G至胞质中，从而诱导不依赖caspase的细胞凋亡。有关细胞色素 C释放的分子机制是目前细胞凋亡研究领域的关键问题。有证据表明，促凋亡蛋白如Bax等能富聚到线粒体外膜上，形成大的通道，从而介导细胞色素C释放。也有人认为，Bcl-2、Bax、Bak能与线粒体膜孔蛋白VDAC和ANT结合，直接影响线粒体膜孔的开放和关闭，从而介导细胞色素C等凋亡相关物质的释放。   
      受体介导的与线粒体介导的细胞凋亡信号途径之间存在相互对话。受体激活的Caspase-8的下游底物之一是促凋亡蛋白Bid，被切割的Bid能更有效地转移到线粒体，并与Bax/Bak相互作用，诱导线粒体细胞色素C释放并激活线粒体介导的细胞凋亡途径。另一方面，有些凋亡因子能激活线粒体凋亡途径，同时也能诱导FasL/TRAIL表达，激活受体相关的信号通路。
      3.细胞介导的细胞凋亡免疫细胞杀伤   
      并不是所有的细胞死亡形式都是细胞自杀性行为。在有些情况下，一种细胞能杀死另一种细胞。在人类和哺乳动物免疫系统中存在T淋巴细胞，它能杀死被病毒感染的细胞和其他受损伤的细胞。杀伤性 T细胞通过细胞膜表面受体识别病毒感染的细胞，如有一种杀伤性T细胞可被穿孔素(Perforin)介导，大量释放丝氨酸蛋白酶Granzyme B等，切割细胞内多种蛋白和激活凋亡中起重要作用的caspases，从而诱导细胞凋亡。T淋巴细胞还通过氧爆发释放大量的自由基来诱导细胞凋亡。
四、凋亡细胞的清除   
$ a' i4 n2 h- ]  @- u! W* |      免疫系统每天要从体内清除超过108个凋亡细胞。淋巴器官、胸腺和骨髓在抗原重排和负向选择过程中有大量的细胞发生凋亡，而淋巴细胞和脊髓细胞生活周期也相对较短。因此，外周免疫系统是一个重要的凋亡细胞中心。在胸腺、骨髓、淋巴小泡等位点，由吞噬细胞快速和高效率地清除凋亡细胞。   
% W% p4 a; f& B+ i, P) o      在细胞凋亡早期，细胞表面膜上出现磷脂酰丝胺酸(PS).。PS通常在细胞质膜内表面，在凋亡过程中，由于转移酶功能减弱，或 lipid scramblase的激活，可引起 PS暴露。PS能被吞噬细胞受体识别，触发吞噬作用。从凋亡细胞中衍生的一些碎片可能由树状细胞或吞噬细胞呈递给淋巴细胞。细胞吞噬过程是一个受基因调控的过程。在C.elegans的14个凋亡基因中，至少有六个基因是与吞噬凋亡细胞相关的基因(见上)。多种细胞膜表面的受体参与了凋亡细胞的识别和吞噬过程。如整合素分子玻连蛋白(Vitronectin)受体αvβ3、αvβ5等、非整合素受体ABC1 (ATP-binding cassette transporter)和CD14等都参与这一过程。有关凋亡细胞的吞噬和消化过程目前尚不清楚。凋亡细胞碎片和被消化的核酸-蛋白复合体有可能作为自身免疫抗原，产生免疫反应，与自身免疫疾病的发生直接相关。此外，由凋亡细胞产生的被消化的蛋白分子短肽可通过树突状细胞(dendritic cells)呈递给淋巴细胞，刺激自身免疫反应。很显然，凋亡细胞的吞噬异常与多种自身免疫疾病直接相关。

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一、细胞凋亡因子与免疫调节功能   
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$ O: ^5 {* d' Z6 s% Y      细胞凋亡调节因子Fas和FasL, TRAIL和DR5等在免疫调节中起着关键作用。Fas在多种细胞表面表达，而FasL主要表达于激活的CD8+T细胞、Thl T细胞和自然杀伤细胞(natural killer, NK)细胞。T细胞和NK细胞分泌的FasL能与表达Fas的细胞相互作用诱导细胞凋亡。在生理状态下，Fas信号通路的主要作用是清除被激活的成熟T细胞和B细胞，清除促炎症免疫分子产生的来源。它在特异免疫位点(immune-privileged sites)的保护中起关键作用。如在眼睛和睾丸等器官，细胞表面大量表达 FasL，能有效杀伤外来的表达Fas的免疫细胞，从而使这些器官免受免疫细胞的攻击。Fas信号通路在免疫排斥、肿瘤相关免疫应答中也起着关键作用。TRAIL是TNF家族的新成员，同FasL一样，TRAIL与受体结合后能直接激活caspase-8和caspase-10，从而诱导细胞凋亡。有意义的是，TRAIL能诱导癌症细胞凋亡，而对正常细胞没有副作用。TRAIL在免疫监控(immune surveillance)中也起着重要作用。许多研究者的研究表明，TRAIL在没有被激活的T细胞中并不表达，但在干扰素作用下，它能大量表达，促进 T细胞的免疫攻击能力，特别是对癌症细胞的攻击。最新的研究还表明，TRAIL还能抑制多种自身免疫疾病的发生，包括类风湿关节炎和硬皮病等。
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( K" m2 r0 F9 |( o二、细胞凋亡与自身免疫疾病   
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      自身免疫疾病的发病率在3%～5%。自身免疫疾病种类很多，包括类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、1型糖尿病(Type I diabetes)等等。很多自身免疫疾病表现出器官特异性，但 SLE则表现全身症状。自身免疫疾病的主要特征之一是体内产生特异的自身免疫抗体，如在RA病人中检测到抗IgG、Fibrin、陪伴蛋白(Chaperonins)等的抗体;从SLE患者循环系统中可检测到抗DNA和组蛋白的抗体，还可检测到抗核糖体(RNP),抗PCNA和Ku蛋白的抗体等。这些抗体在介导特异器官的自身免疫反应中起着关键作用。  

      半个世纪前，研究人员就已发现类风湿关节炎具有多种自身免疫抗体，但为什么免疫系统在每种自身免疫疾病中选择性地作用于自身抗原还没有得到满意的解释。一种可能的假说是:凋亡细胞的产物使宿主具有了免疫性(如核小体、核糖体RNP等)。一些临床的观察结果证实了这种假设，如在系统性红斑狼疮患者循环系统中检测到抗核小体抗体，核小体比单独的DNA或组蛋白具有更强的抗原性。当细胞发生程序化死亡时，许多SLE抗原重新与凋亡细胞小体结合，部分的抗原被修饰，如裂解或磷酸化。抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)能识别这些由凋亡细胞产生的抗原，激活相关的免疫反应。有一类比较特别的抗原是膜磷脂(phospholipid)，大约三分之一的SLE病人血液中出现抗磷脂抗体。在凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine)从细胞质膜的内层翻转到细胞表面。这种外翻使凋亡细胞能被免疫细胞识别，同时也可作为自身免疫抗原。抗磷脂抗体能与膜磷脂和质膜表面蛋白β糖蛋白I（β-glycoprotein I)结合。这种结合可能有利于吞噬细胞对凋亡细胞的清除。另一方面，有些抗磷脂抗体能诱导内皮细胞凋亡，引起血管内皮细胞损伤。

      自身免疫疾病是受基因和环境双重调控的一种疾病。遗传和环境因素从三个不同水平影响自身免疫的敏感性。这三个水平是:免疫系统的反应性、抗原特异性与抗原递呈以及器官特异性。从遗传因素方面，多种基因与自身免疫易感性相关。如细胞凋亡相关基因的变化可导致自身免疫疾病;Fas和FasL突变、Bcl-2表达的变化可导致SLE发生;IL-2缺乏可导致炎性肠病(inflammatory bowel disease)或自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)。组织相容性抗原MHC位点与抗原递呈有关，同时它还参与免疫反应中免疫T细胞的选择。就环境因素而言，感染的细菌和病毒可作为免疫佐剂(Adjuvants)刺激免疫反应，改变T细胞中Thl和Th2细胞之间的平衡造成免疫细胞对特定器官的攻击，产生自身免疫疾病。尽管引起不同疾病的遗传和环境因素各不相同，疾病的临床表现不尽相同，但其起始触发因子可能是单抗原。这种单抗原触发的免疫反应在疾病的发展过程中“扩散”，引起免疫T细胞介导的器官伤害。   
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+ ]. \& i* B0 ^! c! [      在多种情况下凋亡细胞都可能产生免疫原性，比如，一个或多个凋亡途径可能失调，从而导致凋亡产物的异常处理;凋亡细胞吞噬机制发生变化;免疫细胞激活后凋亡细胞的不彻底清除，可能加速周边细胞凋亡或抗原吸收的减少使凋亡细胞可能以佐剂的形式出现。当然，凋亡的异常如何诱发自身免疫疾病还需要进一步研究。

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一、细胞凋亡与类风湿关节炎   
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/ O/ _/ ?1 w5 P, Q5 }      类风湿关节炎是一种自身免疫病。RA的典型特征是滑膜细胞(synoviocytes)的大量增殖和炎症细胞的侵入。在组织学上，RA是以滑膜中炎症细胞积累为特征，导致血管翳形成，软骨及骨组织破坏。一方面，浸润的T细胞和NK细胞大量表达FasL，它能与滑膜细胞表面的Fas结合，激活受体介导的滑膜细胞凋亡。另一方面，成纤维样滑膜细胞则表现为大量增殖，这种细胞具有诸多肿瘤细胞的特点，如表现出肿瘤样增殖、非接触性生长抑制，并对临近软骨和骨组织具浸润特性等。由此看来，细胞凋亡和增殖的失衡是 RA发生的主要原因。当然，总体水平表现为滑膜成纤维细胞增加，主要原因可能是:FasL在滑膜 T细胞表达水平较低，滑膜液中存在的可溶性Fas或FasL竞争性抑制剂可能阻止FasL诱导的细胞凋亡。此外，A型滑膜细胞还分泌 IL-1和TNF-α, B型滑膜细胞和成纤维细胞还分泌TGF-β等，这些因子能激活其下游信号分子如转录因子NF-κB，由此诱导凋亡抑制基因Bcl-XL和Survivin的表达，从而能刺激滑膜细胞增殖，并抑制成纤维细胞的凋亡。RA中凋亡调控因子非常重要，这也为人工治疗提供了机会。用抗-Fas单克隆抗体处理T淋巴细胞Virus-1 tax转基因小鼠，或用Fas配基处理胶原诱导的关节炎，可导致关节炎症状的缓解。用其他方法如调整NF-κB的活性可抑制滑液细胞的生长。

4 p- |: V& x  ]  t, O二、细胞凋亡与干燥综合征   

+ o; d4 l$ r, C; w+ ~$ S' y      许多器官特异性自身免疫病是以免疫细胞介导的，器官内特殊类型细胞死亡为特征的疾病。1型糖尿病的胰岛细胞、多发性脑硬化的树突细胞、干燥综合征的唾液腺和泪腺、多发性肌炎的肌细胞等都会受到自身免疫细胞的攻击。免疫细胞的攻击造成靶细胞凋亡是这些疾病发生的主要原因。在这些疾病中，用TUNEL染色法能直接检测到凋亡的细胞，这直接证明了细胞凋亡在这些疾病发生中的作用。   

      T细胞与许多器官特异性自身免疫疾病的病理过程密切相关。在正常情况下，CD4阳性的T细胞被组织相容性复合体II分子限制，因此不直接攻击靶细胞，但CD4细胞能通过产生细胞因子武装其他效应分子，这些细胞因子可能通过旁路途径，即巨噬细胞诱导组织损伤，或通过“辅助自杀”途径，诱导靶细胞上的细胞死亡受体增加。对于人干燥综合征，Fas或FasL在正常唾液腺中是否持续表达存在争议。

8 s, e" ^. s* L0 W9 _      NOD(nonobese diabetic)小鼠自发地丢失了下颌腺细胞，这可能与其唾液腺细胞中Caspase-1,2,3水平的上升有关。NOD小鼠分泌腺持续表达Fas配基，而NOD和NOD Scid小鼠在 18周才开始表达 Fas，这时NOD小鼠炎症渗透物已很明显。可见，在 NOD小鼠外分泌腺中，Fas表达是一种重要的促凋亡因素。
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( e5 y& W4 ~1 |9 Y" @; o  H三、细胞凋亡与骨关节炎

$ ]% p8 V  L+ ~      软骨细胞凋亡在正常关节发育和骨关节炎(OA)发生过程中都起着重要作用。OA的主要发病机制在于软骨退化。蛋白酶和氮氧化物介导的细胞外基质损伤、新合成的细胞外基质不足是软骨退化的主要原因。OA患者和正常人在表层或中间软骨分化出的软骨细胞都表达Fas，但OA患者对Fas介导的细胞死亡敏感，OA患者的软骨细胞自发性凋亡增加。尽管NO也可能诱导软骨细胞凋亡，但可能不是通过Fas途径而起作用。OA模型实验中，缺乏II型胶原的转基因小鼠(II型胶原是软骨细胞外基质的主要成分)，在其软骨中有高水平的细胞凋亡。以上这些发现表明，软骨细胞凋亡在OA中扮演着重要角色，NO合成的抑制可能在这种病的治疗中存在重要价值。在OA中使用关节内Fas竞争抑制剂的治疗方法可能对软骨细胞有损伤作用。
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      骨质疏松是由于骨组织被过量再吸收及骨组织合成降低引起的。有报道认为:雌激素能诱导破骨细胞的凋亡，从而对骨质疏松的治疗有益。糖皮质激素则可能诱导成骨细胞和骨细胞凋亡而增加骨质疏松。成骨细胞(Osteoblasts)和T细胞表面还表达一种 OPG (osteoprotegerin)和 OCIF(osteoclastogenesis-inhibitory factor)，它们属于TNF受体家族，与其配体 OPGL (OPG ligand/TRANCE/RANKL )结合后能显著抑制破骨细胞增殖。

5 P, c) Q0 g6 [& C四、细胞凋亡与治疗风湿病药物
1 ^5 ~4 T- M; _% b2 W, U6 P& K! _
" P6 W" k7 K. d) F      目前临床使用的治疗风湿病的药物主要包括非类固醇抗炎药(NSAIDs )、免疫抑制剂(如环孢素A、FK506)及细胞毒药物(如甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤)。这些药物在某种意义上是细胞凋亡诱导剂，如NSAIDs是细胞内环氧酶(cyclooxygenase)抑制剂，它能增加细胞内花生四烯酸(arachidonic acid)和神经酰胺(ceramide)的产生，而后者是多种细胞凋亡诱导剂。
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      糖皮质激素(glucocorticoids)具有很强的抗炎作用和免疫抑制作用，因而被广泛用来治疗多种自身免疫疾病。糖皮质激素可诱导多种免疫细胞，包括T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞的凋亡。它在细胞内能与其受体结合，参与调节多种基因，包括细胞周期相关基因、c-myc、 p53、NF-κB和Bcl-2等基因的表达。它还能下调caspase和粒酶B(granzyme B)的表达。大剂量的糖皮质激素通过诱导淋巴细胞的caspase激活来诱导细胞凋亡。长期使用雄激素(steroid)会导致骨质疏松和坏死，这很可能与其诱导成骨细胞和骨细胞凋亡有关。但体外的研究表明，可的松可抑制FasL诱导的成骨细胞凋亡。长期低剂量使用可的松可抑制类风湿关节炎的相关症状。   

      环孢素A和FK506 (tacrolimus)被广泛应用于器官移植中抗器官的排斥。最近也被作为治疗类风湿关节炎的药物。它们能抑制T细胞和B细胞的免疫反应，影响IL-2基因的表达及NO合酶的活性。它们不仅具有免疫抑制功能，而且还通过诱导免疫T细胞和B细胞凋亡来抑制风湿病中的炎症反应。当然，它们能与线粒体基质蛋白分子环孢素A受体结合，抑制线粒体通透性膜孔(permeability transition pore)的开放，从而抑制细胞凋亡。它们还能抑制神经细胞和内皮细胞凋亡，因而被用于神经退行性疾病和心血管疾病的治疗。   

      其他药物如甲氨蝶呤、环磷酰胺是临床上广泛用于治疗癌症的药物。它们可能是通过抑制DNA合成或DNA损伤来诱导癌症细胞凋亡。这些药物很可能通过p53途径或Fas途径来诱导细胞凋亡。鉴于滑膜细胞的癌症特征，利用这些药物来治疗类风湿关节炎是可以理解的。双磷酸酯类(biphosphonates)具有很强的抗骨质吸收作用，在临床上用来治疗代谢性骨科疾病如Paget's病、骨癌等，它很可能是通过诱导破骨细胞凋亡来实现的，其分子机制目前尚不完全明了。

      更为重要的是，细胞凋亡的新进展为新的风湿病治疗药物的开发提供了新契机。在细胞异常加速增殖情况下，如类风湿关节炎的滑膜细胞，可通过影响Bcl-2、caspase的活性，有效地刺激或阻止特定细胞凋亡的发生，从而达到治疗目的。一种有效的途径可能是通过基因治疗的方法，如将caspase或Bax导入特异细胞可诱导细胞凋亡。当然，这类方法必须是相对特异的，因为广谱的刺激或抑制细胞凋亡可导致癌症的发生。而在另一种情况下，由于死亡受体和配体的结合，细胞凋亡加速导致器官功能损伤。通过配体的单克隆抗体和可溶性受体可以阻止凋亡信号，从而达到治疗的目的。如前所述，Fas和TNF能诱导滑膜细胞的增殖和血管生成，在风湿病发生中起着关键作用。利用能与FasL和TNF特异结合的抗体或可溶性受体能有效阻止 FasL和TNF与其受体的相互作用，阻止其促进增殖和促炎症反应的功效，从而达到治疗风湿病的目的。动物试验表明，TRAIL可能对风湿病治疗具有重要作用。  
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      总之，细胞凋亡研究是一个方兴未艾的研究领域，是现代生物学的支柱学科之一。每年有15,000余篇论文发表。这方面的研究对包括风湿病在内的多种疾病的发病机制提供了新的认识角度，为多种疾病的治疗提供了新思路和新途径。                                   
                                                                                                                (陈检)

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