5-第5章自身抗体及其在风湿病发生中的作用

可乐加水 · 发表于 2008-12-15 10:55:23

具有针对自体细胞内抗原的自身抗体是包括系统性红斑狼疮、硬皮病、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、某些肿瘤及副肿瘤综合征等在内的许多疾病的特征。其中一些自身抗体是疾病的特异性标记物，它们的抗原是如核小体、核仁、小核糖核蛋白(snRNPs )、着丝点抗原、线粒体酶和胞质核糖核蛋白(hY-RNP )等细胞内大分子复合物或颗粒。B细胞过度活跃,T细胞功能异常和HLA易感性等多种因素都可能与诱发自身抗体相关。虽然尚不清楚自身免疫反应是如何启动的，不过各种迹象表明，一旦这种反应发生，机体就会在抗原驱动下持续产生自身抗体。

   在过去的十五年中，实验室着重研究系统性风湿病和肿瘤的自身抗原及自身抗体，有两个主要的研究方向:①寻找自身免疫性疾病的抗原，搞清它的特征以理解自身抗体何以在不同疾病状态下产生，再进一步明确它们有无可能作为疾病的有用标记;②利用人类自身抗体作为独特的探针，研究作为自身免疫性疾病靶抗原的新大分子以及亚细胞器的分子和细胞的生物学特征。总目标是，进一步了解这些抗原在正常和病理状况下的基本生物学特征，弄清它们在具有自身免疫原性后是如何诱发不同疾病状态的，以及开发可能对自身免疫性疾病有治疗作用的新方法。

   研究中除了应用诸如免疫扩散、抗核抗体检测和包括免疫印迹法(Western blotting)和免疫沉淀法等其他方法在内的经典的免疫学方法外，还有其他一些检测手段。识别自身抗体靶抗原的常用方法之一是 cDNA表达克隆(图5一1)。简单的说是，在λ噬菌体表达从培养的人细胞系或组织中分离到的cDNA，把表达的重组蛋白转移至硝基纤维素膜，将自身免疫病患者血清中的抗体作为原始抗体，通过免疫印迹法识别表达自身抗原多肽的克隆。经 DNA测序找到阳性候选 cDNA，然后与基因库(GenBank)和其他数据库比较，作进一步识别。从由自身免疫病原始血清识别出的候选克隆中得到纯化的重组蛋白，将其用于筛选表达文库，以核实实验结果。通过对不同疾病组自身抗体的分析，确定其是否与疾病存在相关性，以便进一步评价得到的重组蛋白。

   表5一1列出的是过去十五年中在W. M.Keck自身免疫性疾病中心的实验室用上述方法发现的一组新的人类自身抗原。此表中列出的令人感兴趣的自身抗原包括主要存在于细胞核、核仁和胞浆中的自身抗原，以及在多个亚细胞器中发现的自身抗原。这些自身抗原功能多样，有的是参与RNA转录、维持mRNA稳定、促进其降解及参与细胞周期活动的特异性蛋白，有的是与胞浆细胞器相关的蛋白质。所发现的三种代表性自身抗原涉及哺乳动物 mR-NA聚合酶参与的基因转录。这三种自身抗原是：hUBF/NOR，一个与RNA聚合酶I和核糖体RNA合成相关的转录因子;DFS70/p75，一个与RNA聚合酶II作用过程相关的转录辅助激活蛋白;SS-B/La，一个与 RNA聚合酶III作用过程相关的转录终止子。新近的研究表明，mRNA结合蛋白p62和GW182可以调节mR-NA亚类的稳定性，而 PMScl-75被认为是与mRNA更新和降解相关的外体复合物的成分之一。

   本章概述了就自身抗体在系统性风湿性疾病中的作用所作的研究。目前的研究主要在三个方面:新生儿狼疮、干燥综合征和系统性红斑狼疮中的SS-A/Ro自身抗体;抗高尔基抗体及相关胞质细胞器的自身抗体;肝细胞癌的自身抗体。其中对肝细胞癌自身抗体的研究为理解在疾病中如何诱导产生自身抗体提供了一个非常有用的模型。这些研究为探索自身抗体产生的可能机制提供了有意义的线索，并开始揭示自身抗体在疾病发生中的可能作用。

目录：

第一节 SS-A/Ro 自身抗体及相关的疾病

第二节有关高尔基复合物的自身抗体和自身抗原

第三节肿瘤中的自身抗体

可乐加水 · 发表于 2008-12-16 15:15:45

抗SS-A/Ro抗体常见于干燥综合征(占45%～60%)、系统性红斑狼疮(占35% )和亚急性皮肤型红斑狼疮(占60%～100%)。尽管健康的女性也可有低滴度自身抗体，但高滴度自身抗体对像干燥综合征、亚急性皮肤型红斑狼疮和新生儿狼疮等疾病是高度特异的。如果患儿有新生儿狼疮的心脏及皮肤表现，那么他母亲的血清中通常存在抗SS-A/Ro抗体。从一位患病胎儿心脏中洗脱出了抗SS-A/Ro抗体，提示该抗体可能参与先天性心脏传导阻滞的发病。在妊娠第 4个月早期，母亲体内的抗SS-A/Ro抗体能通过胎盘进入胎儿体内。胎儿血液循环中的这些自身抗体可引发心肌炎症反应，后者对心脏的传导系统造成持续破坏。临床上，狼疮患儿的母亲可能患有系统性红斑狼疮或干燥综合征，但是许多母亲没有任何症状，仅仅是因为生育狼疮患婴才发现体内存在自身抗体。据推测，抗SS-A/Ro抗体在不同疾病亚型特异性脏器的损伤中起着一定作用(图5—2)。例如，光过敏与受紫外光照射患者的抗SS-A/Ro抗体相关联。在新生儿狼疮，皮肤和心脏的受累很常见，尽管如肝脏等其他脏器的受累也有报道。干燥综合征主要的受累器官是唾液腺和泪腺，由于受到细胞浸润，使唾液和泪液的产生明显减少。不过，有些患者其他脏器的分泌功能也会受到抑制。

一、SS-A/Ro自身抗原的分子生物学特征
   迄今为止已经找到了分子量 52kD和60kD两种SS-A/Ro抗原。抗这两种抗原的自身抗体常常同时存在于同一患者的血清中，但这两种自身抗体的交叉反应并不常见。分子克隆和结构分析表明，这两种抗原是由不同基因编码的。
   52kD SS-A/Ro (52α)由475个氨基酸组成。在传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，它与48kD SS-B/La存在于同一条蛋白带中，要分开它们，必须提高单体交链丙烯酰胺凝胶的比例。图5一3A显示全长 52α蛋白的基本特征。52kD蛋白可能与转录调节相关，因为其N端有锌指结构和1个亮氨酸拉链，它们都是转录因子的结构基序。52kD蛋白与几种已知蛋白在整体结构上非常相似。其中有rfp，它是一种与已知为转录位点的PML(前髓细胞白血病)核体相关的癌蛋白。另一种rpt-1，它是IL-2受体和HIV LTR(长末端重复单位)启动子的转录调节剂。最近报道了一种与52kD蛋白在结构上高度相似的称作 SS-56的蛋白质，抗此蛋白质的抗体是在干燥综合征和系统性红斑狠疮中常见的自身抗体。不过其他实验室尚未观察到抗SS-56抗体这么常见。看来要弄清楚抗SS-56抗体和抗52kD SS-A/Ro抗体之间的关系还有很多工作要做。
   52β是52kD SS-A/Ro (52α)的第二种存在形式，是 mRNA变位剪接的结果(如图 3一3A)。52β的中央结构域缺乏由外显子4编码的亮氨酸拉链，它最初是从MOLT-4细胞cD-NA文库中克隆出来的。利用 RT-PCR技术在MOLT-4细胞中可以同时检测到52α和52β,不过52α远多于52β。有意思的是，在胎儿期，体内如心、脑、肾、肺和脾等多个脏器都高表达52β mRNA。在妊娠14～16周期间，52β的表达达到最高峰，而52α则相反。在22～25周的胎儿心脏以及成人心脏中52β mRNA的转录明显减少，此时52α mRNA的转录则处于主导地位。有人提出，既然在心脏发育过程中，当母亲体内的抗体进入胎儿的血循环时52β的表达达到最高峰，而这又恰发生在临床检测出缓慢型心律失常之前，因此可认为52β在心脏传导阻滞的发生中起一定作用。因为目前还不能检测到鼠体内52β的表达，故有关52β体内功能的研究尚十分困难。
   在细胞中占主导地位的 60kD SS-A/Ro(60α)蛋白质有 538个氨基酸。它是一种具有 RNA识别模件(RRM)结构域的RNA结合蛋白，用体外重构检测可以看到它直接与hY-RNAs结合。人、小鼠和爪蟾细胞的60kD蛋白序列中的 RNA结合结构域基本上是保守的。据推断，在它的中央区有一个锌指结构，但由此推断得到的锌指结构在小鼠的同源物中并不保守。目前认为在爪蟾卵母细胞60kD蛋白的功能在对 5S rRNA前体进行新的质量控制或遗弃中起部分作用。因为现在并不知道在哺乳动物细胞里5S RNA与60kD蛋白之间的关系，所以有关哺乳动物细胞60kD蛋白的功能还有待进一步研究。

   像52kD蛋白一样，60kD SS-A/Ro蛋白在MOLT-4细胞中至少也检测到了被称作60β的一种微小形式。它同样是 mRNA变位剪接产生的，与60α不同之处主要在 3’外显子(图5一3B)。虽然用免疫沉淀法以及抗它们各自羧基末端的特异性抗体可以区分60α和60β，但用人抗SS-A/Ro抗体的血清不能区分这两种蛋白。
   52kD和60kD SS-A/Ro蛋白广泛地低表达于各种组织和细胞中。用乙醇/丙酮固定的HEp-2细胞作靶细胞行标准抗核抗体的检测，发现这两种蛋白一般存在于细胞核内。需指出的是，若用多聚甲醛作固定，在HEp-2细胞胞浆也可见染色。除了胞核和胞浆外，培养的人角质细胞表面也有 SS-A/Ro的表达。雌二醇使抗SS-A/Ro抗体与阳性血清中的IgG在人角质细胞表面的结合增强。这提示，SS-A/Ro蛋白依赖雌二醇的表达可能对女性SLE患者的皮肤病变有重要意义。我们的实验资料显示，雌二醇能够增加人角质细胞中52kD和60kD SS-A/Ro mRNA和蛋白的表达。用分离出来的胎儿心肌细胞所做的研究表明，诱导这些细胞凋亡可导致SS-A/Ro和SS-B/La在细胞表面转位，以至于能被抗体识别于活细胞表面。新的看法是，虽然细胞凋亡是程序性死亡，不会引发特征性的炎症，但母体自身抗体与凋亡细胞的结合及随后的白细胞聚集于此会损伤周围健康的胎儿心肌细胞。
二、Ro核糖核蛋白颗粒
   1981年，Lerne:等人研究发现，Ro抗原与被称作hY-RNAs(人胞浆RNA)的富含尿嘧啶的小分子核酸相关，包括hYl,hY3,hY4和hY5。它们是含有84～112个核苷酸的RNA。另一种RNA hY2是hYl的降解产物。现称RNA-蛋白质复合物为 Ro核糖核蛋白(RoRNP )。这些 Ro或 hY-RNAs在生化和免疫上具有异源性。RoRNP中主要的蛋白是60kD SS-A/Ro和48kD SS-B/La。研究表明，这两种蛋白均能直接与 hY-RNA结合。虽然RoRNP的功能尚不清楚，但是在进化过程中，RoRNP成分的保守提示了它们在生物学上的重要性。Y-RNAs藉5’端和3’端之间的碱基配对形成一段保守的干状结构与60kD SS-A/Ro结合，而SS-B/La则与3’寡尿苷酸残基结合。Boire等人未能观察到52kD与经生化手段纯化的hY-RNAs之间的关系，但是在K562细胞，某些抗52kD SS-A/Ro肽抗体可以有效地与hY3-RNAs形成免疫沉淀，这表明52kD SS-A/Ro至少与RoRNP颗粒的一个亚类相关。细胞去核和非洲爪蟾细胞注射的研究显示，RoRNP主要集中于胞浆内。因为SS-A/Ro和SS-B/La抗原也能在细胞核内检测到，故这些抗原可能表达于细胞的多个部位。
三、抗体的致病机制
   许多研究人员继续支持这样的假设，即自身抗体可以穿入活体细胞，通过直接干扰相关抗原的亚细胞功能发挥它们的致病作用。不过，即使接受“抗体穿入”假设，研究者仍然对活体细胞内自身抗体的致病机制知之甚少。尚不清楚的是，假如自身抗体在体内达到了能进入活体细胞的水平，是否就足以抑制其靶分子的功能。不过有人提出，穿入细胞的自身抗体通过自身反应性淋巴细胞的凋亡可诱发机体对自我的耐受，并且通过异常调节和/或对细胞的破坏引发自身免疫性疾病。这个有可能令人感兴趣的假设当然会引起争议，显然需要做更多的研究才能为这个假设提供有力地支持。
   对于SCLE和 NLE来说，抗 SS-A/Ro自身抗体被认为能够引起皮肤组织损伤(图3一2)。Lee和他的同事用小鼠模型检测到人抗SS-A/Ro抗体能与移植于无胸腺小鼠的人皮肤相结合。因为 SS-A/Ro和 SS-B/La主要位于胞核和胞浆，假如不考虑“抗体穿入”这一假设，那么有必要明确胞内的抗原是如何被胞外自身抗体识别的。可能需要二次损伤才可使自身抗体具有对易感脏器的致病性。有报道指出，用紫外线、雌激素、CMV病毒感染、UVB或TNF-α等处理，以及在细胞凋亡过程中，都会使 SS-A/Ro和SS-B/La转位至细胞表面。但是，也有报道不支持在病毒感染的过程中或暴露在紫外光下细胞表面会表达SS-A/Ro和SS-B/Lao应该指出的是，即使在细胞表面表达这些自身抗原，仍不能全面解释自身抗体的致病机制。
   当培养的人角质细胞经紫外光照射出现凋亡时，凋亡小泡内发现SS-A/Ro和SS-B/La抗原。有人提出，表达于细胞表面的抗原也许驱动了相应的自身免疫应答。作为一种对诸如抗SS-A/Ro和SS-B/La自身抗体诱导的有吸引力的假设，这个说法引起了很多研究者的关注。但是，必须指出的是，在发育阶段，细胞凋亡是一种正常的过程，主要起调节机体内稳态的作用。生理性细胞凋亡不太可能在与系统性风湿病相关的自身抗体的诱发中起作用。不过在特殊情况下，例如，对与先天性心脏传导阻滞相关的抗SS-A/Ro抗体来说，如果这种抗体在细胞凋亡前即存在，那么在凋亡心肌细胞表面表达的SS-A/Ro和SS-B/La就可解释病变发生的部位。
   正如Provost和Reichlin所述评的，皮肤狼疮性损伤与存在于表皮和真皮交界处的免疫球蛋白及补体相关。用直接免疫荧光法可在该处检测到补体膜攻击复合物(CSb-C9)。对于先天性心脏传导阻滞的发病来说，可以从下面得到炎症反应的证据:在一个 18周大的宫内死胎的心肌中见到单核细胞的浸润;此外，在一个妊娠30周娩出并于产后很快死亡的婴儿的心肌中见到片状淋巴细胞的聚集，而且，免疫荧光法显示有 IgG、补体(包括 Clq, C4, C3d, C6和C9)和纤维素的沉积。在另外两个有关胎儿先天性心脏传导阻滞的研究中，也找到了自身抗体参与发病的蛛丝马迹。在其中一个心肌纤维的表面检测到 SS-A/Ro抗体独特型的母体IgG，在另一个心肌洗脱出抗 SS-A/Ro抗体。用注射免疫纯化的人抗SS-A/Ro抗体进入兔子心脏的方法建立一个动物模型，目的是印证在先天性心脏传导阻滞的发病过程中抗 52kD SS-A/RO抗体的致病性。Buyon的实验室建立的动物模型为证明抗SS-A/Ro和SS-B/La抗体，特别是抗52kD SS-A/Ro抗体在先天性心脏传导阻滞发病中的作用，提供了强有力的证据。
   目前尚未弄清SS-A/Ro抗原在哺乳动物细胞中的功能。因为用免疫荧光法发现60kD SS-A/Ro和hY-RNA之间存在直接的相互作用，故推测60kD蛋白参与了hY-RNA的生物形成过程。因此，已开始寻找在生物学上能与60kD SS-A/Ro抗原相互作用的已知或新的细胞蛋白质，以了解SS-A/Ro抗原在细胞功能以及发病中的可能作用。SS-A/Ro抗原有可能与参与触发自身抗体形成的细胞内的其他成分形成复合物。在不同的受累脏器中找到与SS-A/Ro相互作用的物质，这可能是明确抗SS-A/Ro抗体在受累脏器独特的发病机制中所起作用的重要一步。

可乐加水 · 发表于 2008-12-16 15:17:49

在一位干燥综合征合并淋巴瘤患者的血清里第一次发现了抗Golgi抗体(AGAs )。此后有许多文章报道了在干燥综合征和系统性红斑狼疮等系统性风湿病，以及如原发性雷诺现象、原发性小脑性共济失调和乙型肝炎病毒或人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染等其他疾病患者的血清中发现AGA。虽然在这些报道中患者的人数很少，但它们提示干燥综合征和系统性红斑狼疮是与AGA相关的最常见疾病。令人感兴趣的是，据报道HIV患者血清里出现AGA频率非常高，但只有通过进一步的研究，证实该发现对其他HIV人群同样适用，才能明确它真正的意义。免疫印迹法和免疫沉淀显示，至少存在14种分子量在35kD～260kD之间的不同的Golgi抗原，它们造成 AGA反应的异源性，这种结果使AGA的临床意义进一步复杂化。
近十年来，部分实验室已经克隆并识别出7种新的Golgi自身抗原(表5一2)，它们主要是用人自身抗体作为探针，从表达性文库克隆得到的。这些Golgi自身抗原分别称为Golgin-67、Golgin-95(GM130)、Golgin-97、Golgin-160(GCP170)、GMAP-210、Golgin-245(p230/GCP230)和giantin (macrogolgin/GCP )，之所以这样命名，至少一部分原因是基于它们在变性条件下用SDS-PAGE法估测到的分子量。有意思的是，从这些Golgi自身抗原的氨基酸序列看，除了氨基端和羧基端的结构域之外，它们主要是由α-螺旋构成的螺旋-螺旋结构(coiled-coils )(图 5一4)。此结构预示着这些Golgi蛋白具有共同的生化特征，这与某些疾病状态下诱发的自身免疫反应相关。

一、Golgi体自身抗原的一般特征
在所检测到的Golgi体自身抗原之间有高度相关。用 COILS和PAIRCOIL分析软件对螺旋-螺旋区所作的预测分析发现它们具有相似的二级结构(图5-4)。人类对Golgi体的自身免疫反应似乎是高度特异的，因为许多含有AGA的血清只与它们中的一个或两个抗原发生反应。因此，所发生的免疫反应不可能只针对这些自身蛋白中有交叉反应的螺旋-螺旋区。螺旋-螺旋也见于包括细胞核有丝分裂相关蛋白NuMA, lamin B、肌球蛋白重链、52kD SS-A/Ro和70/80kD Ku等其他一些非Golgi体自身抗原中。尚需指出的是，当用一个大家熟知的无螺旋-螺旋功能域的反式Golgi体标志蛋白TGN38来检测 AGA血清中抗此蛋白的存在状况时，不管是对重组蛋白做免疫印迹，还是用体外翻译蛋白做免疫沉淀，没有一个血清样品与 TGN蛋白发生反应(未发表资料)。免疫胶体金染色电子显微镜观察和/或生化分离方法观察到，这些Golgi体自身抗原中有许多定位于Golgi体池的胞浆面(图5一5)。简单的说，现有的资料与有关抗Golgi复合体自身免疫反应主要是针对高尔基体胞浆面的某些富含螺旋-螺旋结构的外周蛋白(golgins)和穿膜蛋白(giantin)的假设是一致的。

二、Golgins的功能
   观察迄今克隆得到的所有Golgi体自身抗原，发现在中央区都有杆状α-螺旋构成的螺旋-螺旋结构，而在末端区不存在螺旋结构，这为进一步了解其功能提供了线索。主要基于从中国仓鼠卵巢细胞中纯化到的Golgi体片段所作的电子显微镜和冷冻干裂法分析，Orci、 Perrelet和Rothman提出了Golgi体囊泡(vesicle)结构的“绳索理论”(string theory)。他们认为，转运小泡在生存期停留于邻近其起源的 Golgi stack，这有利于小泡的转运主要在 stack邻近池中进行。他们以此理论推测，藉限制和保持小泡于紧密相邻的“绳索”而把小泡连在一起，这解释了小泡的“列队性”转运。令人感兴趣的是，完全有理由推测这些“绳索”由如GM130和giantin等富含螺旋-螺旋结构域的大分子组成。“绳索”理论推断，这些富含螺旋-螺旋结构的Golgi体蛋白在约束小泡转运过程中起主要作用。这个家族中的蛋白也许还有一种作用，即通过顺序化的特定相互作用，引导小泡逐一向Golgi体自身抗原家族的成员移动。
   在寻找是否存在着与胞浆细胞器相关联的富含螺旋-螺旋结构的自身抗原超家族过程中发现，除了上面提到的golgins，值得注意的是尚有一组新的人自身抗原家族。这组自身抗原有以下特点:①高分子量的蛋白质(l00kD～400kD);②分子的中央区富含杆状螺旋-螺旋结构域，而两端则为非螺旋-螺旋结构域或球状结构域，是一种连接型分子;③这些自身抗原与如Golgi复合体、核内体、中心体、有丝分裂的着丝点和位于中心体两侧的纺锤极等胞质细胞器或区室相关;④这些蛋白，如GM130, golgin-160 ,giantin等，位于细胞质的一侧。180kD的早期内体自身抗原EEAl也是一种富含螺旋-螺旋结构的蛋白质，它同样位于内体膜的胞质侧。研究者发现中心体中也有越来越多的中心粒固有自身抗原家族成员符合上述特征，如220kD的中心体外周蛋白(pericentrin)、 245kD和 249kD蛋白质的变位剪切产物 ninein,280kD的Cep250蛋白。在已发现的中心粒自身抗原中，只有两种与本文所讨论的内容相关，它们是CENP-E和CENP-F。这两种自身抗原都是高分子量蛋白质(312 ～400kD )，而且它们的总体结构与上述蛋白属于同一类型。NuMA是位于有丝分裂纺锤极的另一种含有螺旋-螺旋结构的蛋白质，在有丝分裂纺锤体细胞器染色检测中，它是血清中最常见的自身靶抗原。尚不清楚免疫系统为什么以及如何识别和靶向这些蛋白质的，尽管这个现象十分明显(图5一6)。据推测，在外伤或感染导致的细胞非规律性死亡等异常疾病状态下，具有螺旋-螺旋结构的自身抗原“超家族”可能作为细胞器的表面结构被释放或暴露于免疫系统，从而被识别。上面讨论的有关富含螺旋-螺旋结构的自身抗原“超家族”的概念是一个新的课题，值得进一步研究，以便了解它们在诱导自身免疫反应中是否具有一种共同的机制。这组具有独特结构的自身抗原/自身抗体在发病机制中是如何起作用的也有待进一步探讨。

可乐加水 · 发表于 2008-12-16 15:19:04

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者中自身抗体的存在状况及其对相关自身抗原的识别已成为令人感兴趣的一个主要研究领域。研究计划最初假设，肿瘤患者产生的自身抗体针对的是细胞从慢性肝病转变为肝癌过程中过表达或异常调节下表达的蛋白。这个假设主要来自对日本慢性肝病患者的追踪研究，这些患者最终都发展为肝细胞癌。HCC在肿瘤中比较独特，因为有可能找到一群经过十年或更长时间后发展成为HCC的癌前期患者。已观察到大约三分之一的HCC患者血循环中有抗某些胞内抗原的自身抗体，而且在这些患者中有一些是由慢性肝病转变为肝细胞癌的，这种转化与出现的新自身抗体相关。有人提出，这些新抗体是对参与恶性变过程的抗原的免疫应答。有实验室用肝细胞癌患者血清中的抗体做免疫筛选，找到了几个令人感兴趣的细胞内蛋白，但本文仅集中描述主要与自身抗原p62相关的新进展。

一、抗与IGF-II mRNA相结合的p62/IMP-2蛋白的抗体

   用Western印迹法分析一组来自中国肝细胞癌患者的血清，观察到其中许多血清识别一种分子量大约是62kD的胞质蛋白(p62)。此p62蛋白在肝癌细胞系HepG2和膀胱癌细胞系T24高表达，而在T淋巴细胞株MOLT-4低表达。用一份含高滴度p62抗体患者的血清免疫筛选HepG2和T24细胞cDNA表达文库，分离到了一个全长cDNA克隆。从分析p62蛋白的编码核苷酸序列可知，这是一个从未报道过的新基因。最令人感兴趣的是，发现由此 cDNA推测的p62蛋白的氨基酸序列与mRNA结合蛋白中的一个小蛋白家族高度同源。

   图5一7描述了p62蛋白及两个相似蛋白ZBP1和Koc的特点，显示出它们独特的RNA结合功能域。该蛋白家族成员的 N端区有RNA识别模体(RRM )，在它的中段到C端有四个hnRNP K同源(KH)结构域。在早期发表的有关p62蛋白的文章中，只报道了1个氨基端RNA识别模体(RRM)和4个KH功能域。但根据用包括BLASTP等最新序列分析程序所作的分析，现已明确在氨基端存在两个RNA识别模体(RRM)。Nielsen和他的同事报道他们已识别出三个相关的人类基因产物，它们是胰岛素样生长因子II (IGF- II)先导肽3mRNA的5’端非翻译区结合蛋白。这些 IGF-II mRNA结合蛋白IMP-1, IMP-2和 IMP-3是在从棒状肉瘤细胞株中分离与IGF-II mRNA结合的蛋白过程中发现的。在发育过程中IMPs的表达受到调控，在胎儿时期表达，在正常成人组织中则检测不到。IMP-1, IMP-2和IMP-3分别由位于17号、3号和7号染色体上的基因各自编码。除了在因共同前体基因转录的差异mRNA剪接所致的KH2和KH3的功能域间插入第43位氨基酸外，IMP-2与p62蛋白完全一样。IMP-3与蛋白Koc相同，是含有肿瘤中过表达的KH结构域的蛋白质，它最初是在胰腺癌和正常组织间的差异显示分析中发现的，Koc在大多数正常组织中不表达。人类的IMP-1与鸡 ZBP-1和小鼠CRD-BP同源。ZBP-1是一种“拉链码(zipcode )”结合蛋白。它最初被认为是结合于β-肌动蛋白mRNA3’端非翻译区(UTR)保守的54核苷酸RNA拉链码(zipcode)元件的蛋白之一，根据需要它被定位于成纤维细胞的前缘。虽然 ZBP-1在肿瘤发生中的作用尚不清楚，但已知它对癌变中起关键作用的细胞迁移来说十分重要。CRD-BP被认为是编码区的不稳定决定簇结合蛋白(the coding region instability determinant bindingprotein)，它结合并保护c-myc mRNA，使之免遭内切酶切割，由此延长c-myc在体内的半衰期，这对细胞增殖和肿瘤发生有重要影响。因此，这个家族所有成员的一个共同特征是:它们都是mRNA结合蛋白，结合于不同类型mRNA的5’非翻译区(IMPs)、编码区(CRD-BP)或3’非翻译区(ZBP-1)。必须指出，这些IMPs还可能与其他mRNA结合，所以目前正在进行更多的研究以明确它们在体内的结合特异性。

   三种IMPs均与肿瘤有一定关系。IMP-1 /CRD-BP和 IMP-3 /Koc与肿瘤之间可能存在的关系在前面已经作了简短的介绍。IMP-2/p62被认为是一种自身抗原，自身抗体出现在21%的HCC患者体内，但是在慢性肝炎和肝硬化则不出现。免疫组化研究显示，在人的HCC癌结节组织中p62和Koc呈异位表达。IGF-II在许多肿瘤中过表达，最早见到的是它在人HCC的过表达。有一种叫Beckwith Wiedemann综合征的遗传性疾病与IGF- II过表达有关。该综合征表现为巨大内脏和不同脏器的肿瘤。目前已经建立了IGF-II过表达的转基因动物模型，并已导致转基因动物形成肿瘤。在乙肝病毒转基因小鼠，某些小鼠已由慢性肝细胞损伤发展为HCC，在检查包括ras , myc , fos ,abi , src , Rb和p53等大量的癌基因和肿瘤抑制基因其结构和表达是否有异常的过程中，只见到IGF- II呈过表达。

二、在慢性肝病转变成 HCC的过程中对p62的体液免疫应答

   对有价值的文献复习发现，HBV或HCV相关的慢性肝炎和肝硬化是HCC常见的癌前期疾病，因为它们有可能发展成为HCC，这是HCC的特征之一。在许多国家，HBV和HCV的感染十分普遍。对慢性肝病患者进行有规律的门诊随访治疗，有利于肝癌的早期发现。收集其中一些患者在若干年内的一系列血清样本，以及复习过去报道的研究成果，发现新的自身抗体出现于癌变过程中，而不是在肿瘤前期的慢性肝病阶段。对于HCC来说，发现癌变过程中新的自身抗体以及与其相关的自身抗原的特征，有助于理解胞内蛋白参与癌变的途径。近来分析了一组来自日本17例HCC患者的一组系列血清样本。在慢性肝病转变为HCC的过程中，发现抗p62抗体和抗CENP-F抗体(图5一8)。CENP-F是与着丝粒相关的330kD蛋白，它的表达呈细胞周期依赖性，在分裂间期与核基质有关，在G2期和有丝分裂期CENP-F的表达达到高峰，此时它位于浓聚的染色体的着丝粒上。有一项研究显示，接受随访的36例患者中有22例存在抗CENP-F抗体，而这些人患有包括乳腺癌和肺癌在内的各种肿瘤。这份前瞻性研究提示，癌变可能与自身抗体对胞内某些蛋白的反应相关，而这些蛋白在癌变过程中起一定作用。

三、抗p62和Koc的自身抗体在HCC和其他肿瘤中广泛存在

   如上所述，在21%的HCC患者体内发现了抗p62抗体，但是作为HCC癌前期疾病的慢性肝炎和肝硬化患者并不出现该抗体。令人感兴趣的是，Koc在胰腺癌和其他肿瘤中有转录性过表达。上述这两种蛋白在结构域和氨基酸序列以及它们与肿瘤的关系等方面都十分相似，这促使对它们进行深入的研究，以确定不同类型的肿瘤患者对这两种蛋白产生的体液免疫反应，并分析被这些自身抗体所识别的p62和Koc中的抗原决定簇的异同。新近研究了在不同类型的恶性肿瘤中抗p62和抗Koc自身抗体出现的范围和频率、抗原中的表位及是否存在交叉反应性抗体。从全长或部分cDNA表达出重组多肽，并将其作为抗原用于免疫印迹法、ELISA和免疫沉淀法检测。在检测到表位后，用重组多肽行交叉吸收以确定血清的特异性。分析了777例十种不同类型恶性肿瘤患者的血清后得出以下结论:11.6%的患者有抗p62抗体，12.2%的患者有抗Koc抗体，累计约有20.5%的患者存在抗这两种自身抗原中之一的自身抗体。这些数值与包括正常人群和自身免疫病患者在内的对照组之间有很大差别。这两种抗原的免疫显性抗原决定簇位于氨基端。吸收试验表明，绝大多数自身抗体不存在交叉反应。抗p62抗体和抗Koc抗体在各种类型的恶性肿瘤中出现的频率大致相当，对它们的免疫应答似乎是相互独立的。

   在以往对系统性风湿病相关自身抗原和相应自身抗体应答意义的研究中，很多研究者揭示了自身抗体的应答主要是由抗原驱使产生的。细胞内抗原诱发自身免疫应答的理由尚未完全弄清，也许基因突变导致了异常蛋白的产生或基因表达的失调，如癌胚蛋白的异位表达。这些情况可能也适合于p62和Koc自身抗体的产生，但是其他机制也应考虑。在不同类型的肿瘤中，抗p62抗体和抗Koc抗体的出现频率和广泛分布与抗p53抗体的出现频率和分布相一致。假如这种现象与这些 mRNA结合蛋白的异常表达有关，那么肿瘤发生的一条途径可能是通过IGF- II表达的失调产生的。对p62和Koc转基因小鼠作深入研究应能帮助我们更好的理解这些蛋白是如何在恶性肿瘤中产生作用的。

四、p62在HCC中的异常表达

   在最近的研究中，用免疫组化的方法检测了一组用石蜡包埋保存的HCC组织块，大约三分之一患者的HCC结节高表达p62蛋白，而在相邻的非肿瘤性肝实质细胞内则无异常染色。另外，正常成人肝组织中也检测不到p62。进一步的研究显示，人胎肝脏在 mRNA和蛋白水平均有p62表达，但是在成人肝组织中检测不到或极弱。这些资料与胎儿和成人组织中IMP表达的特点相一致。在肝硬化结节内散布的细胞中检测到了p62表达，而在HCC结节中所有的细胞均检测到p62表达。这些研究显示，在发育过程中p62的表达受到调节，它在胎肝表达，在成人肝脏不表达，而在HCC中呈异常表达。P62可能通过对诸如 IGF- II生长因子表达的调节，在HCC和肝硬化的细胞异常增殖中起重要作用。

   系统性自身免疫性疾病中高特异性的自身抗体应答通常预示着疾病的生物学表现型，这使这些自身抗体在临床上更有价值，在诊断中更有意义。许多实验室的研究结果证明，诸如p62/IMP-2, koc/IMP-3、IMP-1、p53和 c-myc等肿瘤相关抗原的自身抗体也许有可能作为肿瘤的标志物。需保留的是抗个别肿瘤特异性抗原的自身抗体达不到能常规地用于诊断所需的敏感水平。随着研究的深入，观察到多种自身抗体的组合能提高疾病诊断的敏感性。可以想像，未来会发现针对肿瘤抗原不同列阵的自身抗体谱，这对肿瘤的诊断将有帮助。

   基于对自身抗体与风湿病发病之间关系的理解，上述对p62和肿瘤的研究提示，对目标脏器中是否存在自身抗原的异常表达做再次检查是有用的。今后的研究目标之一是，检测如干燥综合征这样有明确的靶器官组织且利于评价的疾病其自身抗原谱的表达水平。希望通过检测自身抗体的靶抗原可以更好的理解疾病的发病机制。
                                                                                                                                                                                                                           ( Edward  K. L. Chan )

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5-第5章自身抗体及其在风湿病发生中的作用

5-1-第一节 SS-A/Ro 自身抗体及相关的疾病

5-2-第二节有关高尔基复合物的自身抗体和自身抗原

5-3-第三节肿瘤中的自身抗体

5-第5章 自身抗体及其在风湿病发生中的作用

5-1-第一节 SS-A/Ro 自身抗体及相关的疾病

5-2-第二节 有关高尔基复合物的自身抗体和自身抗原

5-3-第三节 肿瘤中的自身抗体

5-第5章自身抗体及其在风湿病发生中的作用

5-2-第二节有关高尔基复合物的自身抗体和自身抗原

5-3-第三节肿瘤中的自身抗体